论文部分内容阅读
卵巢癌的常规治疗方法包括外科手术治疗和化学药物治疗。卵巢癌化疗耐药的存在使化学药物治疗效果不理想，人们对耐药相关机制进行了一系列研究并取得了一定进展。寻找攻克卵巢癌化疗耐药的新方法，是目前研究的热点。银杏内生真菌发酵物Rosoloactone，作为一种新的抗肿瘤药物，可以诱导人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP发生凋亡，并且逆转顺铂耐药。研究Rosoloactone的作用机制，不仅能够开发出新的抗肿瘤药物，还有可能为解释肿瘤耐药提供实验依据。P62是一个具有多功能结构域的磷酸蛋白，与细胞复制及生存有关。研究发现p62在细胞存活，包括增殖，分化和抗凋亡基因诱导方面发挥功能，并且在多种肿瘤异常表达，有人认为p62作为各种泛素化底物选择性自噬的衔接受体，参与了细胞内环境稳定的调控，维持细胞的存活。已有研究表明，细胞顺铂耐药的形成与内质网应激和未折叠蛋白反应有关。当细胞发生内质网应激时，错误折叠蛋白和未折叠蛋白过量堆积，触发未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response，UPR），除了经典的内质网相关蛋白降解（ER-associated protein degradation，ERAD）途径参与降解堆积蛋白以外，还可激活另一细胞降解途径-----内质网激活的自噬（ER-activated autophagy，ERAA）途径。本实验主要以人卵巢顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP为研究对象，探讨银杏内生真菌发酵物Rosoloactone在逆转人卵巢癌细胞顺铂耐药中的作用及其机制，为肿瘤耐药的临床治疗提供新的方向。方法(1)利用MTT法检测SKOV3/DDP细胞生存率；Hoechst33258染色观察细胞核形态；Western blot分析细胞Cleaved Caspase-3蛋白的表达；流式细胞术检测SKOV3/DDP细胞凋亡率；TUNEL染色检测SKOV3/DDP细胞凋亡。(2)流式细胞术检测SKOV3/DDP细胞线粒体膜电势；Western blot方法检测Bcl-2、Bax、Bak蛋白的表达；免疫荧光分析SKOV3/DDP细胞线粒体及细胞色素C的表达。(3) Western blot方法检测内质网应激相关蛋白Grp78、Cleaved caspase-4，泛素化蛋白ub的表达。(4)Western blot方法检测细胞中p62、LC3蛋白表达；间接免疫荧光技术检测p62与LC3的共定位。(5)DCFH-DA方法检测ROS水平；western blot方法检测γ-H2AX的表达；免疫荧光技术观察γ-H2AX的表达。结果1.顺铂联合Rosoloactone能够显著抑制人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP的增殖，并呈现时间依赖性和剂量依赖性。与对照组、顺铂组和Rosoloactone组相比，顺铂联合Rosoloactone作用于SKOV3/DDP细胞，可诱导细胞发生显著凋亡。2.顺铂联合Rosoloactone诱导SKOV3/DDP细胞的线粒体膜电势下降，Bak蛋白表达显著增高，Bax/Bcl-2的比值显著升高，细胞色素C释放，CleavedCaspase-3蛋白的表达增强，提示顺铂联合Rosoloactone可能通过线粒体途径诱导SKOV3/DDP细胞发生凋亡。3.顺铂联合Rosoloactone引起SKOV3/DDP细胞Grp78蛋白、Cleavedcaspase-4表达增强；泛素化蛋白表达增多。顺铂组及Rosoloactone组作用SKOV3/DDP细胞，均可以引起SKOV3/DDP细胞p62蛋白表达水平降低，而顺铂联合Rosoloactone，p62蛋白的表达水平明显低于对照组，也显著低于顺铂组及Rosoloactone组。利用间接免疫荧光技术发现，顺铂联合Rosoloactone组由于p62表达非常弱，未见明显的p62与LC3共定位情况。以上结果提示顺铂联合Rosoloactone能够引起内质网应激介导的细胞凋亡。4.顺铂联合Rosoloactone引起SKOV3/DDP细胞ROS表达水平显著增高。.顺铂联合Rosoloactone引起γ-H2AX表达显著增高，提示顺铂联合Rosoloactone诱导SKOV3/DDP细胞DNA损伤。结论本实验以人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP为研究对象，采用不同浓度的银杏内生真菌发酵物Rosoloactone、顺铂、顺铂联合Rosoloactone，分别作用于SKOV3/DDP细胞，发现顺铂联合银杏内生真菌发酵物Rosoloactone能够显著抑制SKOV3/DDP细胞的增殖，诱导细胞凋亡。1，顺铂联合Rosoloactone通过诱导人卵巢癌SKOV3/DDP细胞ROS水平升高、线粒体膜电势降低，可以推断顺铂联合Rosoloactone引起SKOV3/DDP细胞线粒体膜通透性增加，释放细胞色素C，导致caspase家族激活，诱导细胞凋亡。2，顺铂联合Rosoloactone可能诱导SKOV3/DDP内质网应激相关蛋白的表达，推测顺铂联合Rosoloactone可能诱导SKOV3/DDP细胞错误折叠蛋白增多，通过诱导细胞内质网应激引起细胞凋亡。3，顺铂联合Rosoloactone组p62表达减弱，LC3II表达增多，激光共聚焦显微镜观察结果显示，顺铂联合Rosoloactone作用SKOV3/DDP细胞，p62与LC3的共定位减少，表明自噬下降，内质网内错误折叠蛋白增多，发生内质网应激，最终导致细胞死亡。4，进一步检测γ-H2AX证明Rosoloactone联合顺铂具有诱导SKOV3/DDP细胞DNA损伤的作用，从而诱导细胞凋亡。