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目的:探讨浸提时间、乙酸浓度及料液比对鼠尾腱胶原提取的影响,建立并优化鼠尾腱胶原的提取工艺,提高胶原提取效率。构建复合重组人骨形态发生蛋白(rh BMP-2)的胶原/壳聚糖-明胶微球双缓释体系,并评价其缓释rh BMP-2的效果,及重组人骨形态发生蛋白(rh BMP-2)促进骨缺损修复的能力,为骨组织工程促进骨缺损的修复提供新的思路。方法:由于各种急慢性损伤、炎症、肿瘤、先天畸形等因素造成的骨缺损的修复是亟待解决的重大临床难题之一,骨组织工程支架为诱导骨缺损区的骨再生提供了一个崭新的治疗途径。前期研究证实重组人骨形态发生蛋白(rh BMP-2)具有良好的诱导骨再生能力,但是rh BMP-2突释效应显著且半衰期较短,与载体结合后在体内容易失去生物活性而严重影响其诱导骨再生能力。本研究选取生物活性良好的胶原及壳聚糖作为原材料制备成水凝胶载体,并制备缓释效果良好的明胶微球,将微球包埋于水凝胶中构成双缓释体系。对原材料胶原蛋白的提取工艺进行了优化,选取健康SD大鼠鼠尾,采用酸溶法提取鼠尾腱胶原,计算不同浸提时间、乙酸浓度及料液的胶原提取率,利用正交试验判断浸提时间、乙酸浓度及料液比等影响因素的最佳工艺参数,并通过SDS-PAGE电泳试验、单宁酸沉淀试验、傅里叶红外光谱试验等对提取的胶原进行鉴定。为了使rh BMP-2能更好的应用于骨组织工程,我们构建了缓释rh BMP-2的胶原/壳聚糖-明胶微球(CC-GMS)支架,并通过体外实验对支架的微观结构,成胶时间,降解性,缓释性能以及生物学活性进行系统的评价。为了验证缓释rh BMP-2的CC-GMS支架对骨缺损修复的能力,我们采用新西兰白兔下颌骨缺损实验模型,对比不同的支架材料的骨修复效果,并采用软X-ray,螺旋CT三维重建,Micro CT,骨矿含量骨矿密度的定量分析及组织学检查对其骨缺损的修复进行评价。结果:正交试验结果显示鼠尾腱胶原提取的最佳工艺参数为浸提时间72h、乙酸浓度0.5M、料液比为1:40,SDS-PAGE电泳显示样品为Ⅰ型胶原,单宁酸沉淀试验显示胶原降解程度低,傅里叶红外光谱显示胶原结构完整。样品氨基酸含量测定符合胶原蛋白的成分特征。制备的明胶微球粒径为50~150um,呈球形,无明显粘连。SEM观察微球表面具有多孔结构,易于吸附液体。CC-GMS支架酶解稳定性良好,缓释效果良好,30d累计rh BMP-2释放率75.11±4.36%。分离提取的大鼠BMSCs生长状态良好,细胞周期检测大部分细胞处于相对不活跃的静止期,流式检测,基本不表达CD34、CD45,高度表达CD90。BMSCs成功诱导分化为成骨细胞及成脂细胞,茜素红、红油O、碱性磷酸酶染色阳性。生物学活性检测表明,BMSCs在CC-GMS支架中生长良好,培养7d细胞数显著增多。软X线检测结果,与CC-GMS组(A组)相比,rh BMP-2/CC组(B组)和rh BMP-2/CC-GMS组(C组)具有更好的骨修复效果,术后12W,C组显影明显,缺损区几乎被新生骨填满完全治愈,且在第6w、12w均表现出了更好的骨修复效果。此表现从螺旋CT和显微CT结果中进一步得到验证。术后12w,A、B、C三组新骨量分别为44.59±6.20mg、49.34±4.89mg、57.29±3.2mg,差异存在显著性,P<0.05。骨体积分数作为新骨形成的相对量指标,在术后12w,rh BMP-2/CC-GMS组显著高于其他组,差异存在显著性。骨矿密度表现出相似的结果。术后12w,C组Masson染色显示出致密的板状骨结构并有规律的排列,骨缺损区被大量的新骨占据,表明C组具有更好的诱导骨再生能力,与影像学结果一致。结论:成功建立并优化鼠尾腱胶原蛋白的提取工艺,得出浸提时间、乙酸浓度及料液比等因素的最佳工艺参数,有效提高鼠尾腱胶原的提取效率。构建的CC-GMS支架具有良好的生物相容性并能够持续缓释rh BMP-2。构建的缓释rh BMP-2的CC-GMS支架在体内具有良好的诱导骨再生能力,作为组织工程骨替代物有一定应用前景,为组织工程在骨缺损修复的研究提供了新的研究思路。