肠杆菌科细菌是重要的医院感染病原菌,因不规范的抗菌药物使用,肠杆菌科细菌对抗菌药物的耐药状况不断恶化,致使它们对大多数临床常用的药物的耐药率>50%。碳青霉烯类抗生素是仅剩的几种对大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌还保持高敏感性的药物,近来出现了越来越多的对碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌,严重威胁着抗感染治疗,引起了世界各国抗感染专家和临床微生物工作者的极大关注。KPC型碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase, KPC)的产生是目前引起肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。现有文献显示携带blaKPC-2的转座子广泛存在于不同大小、不同结构的质粒中,其中大多数质粒可通过接合试验成功转移至受体菌,携带blaKPC-2的宿主细菌也多种多样。中国KPC酶(blaKPC-2编码)的流行涉及转座子、质粒和宿主三个环节。我们认为blaKPC-2的流行可能并非简单克隆播散,可能是由高活动能力的转座子介导,由宽宿主、稳定、转移能力强的质粒,通过接合播散至广泛流行的不同种类的肠杆菌细菌。课题组收集自华山医院blaKPC-2初现到爆发时间段内所有肠杆菌科分离株为研究对象,首先对转座子、质粒和细菌进行恰当的分型,然后研究每一流行环节的特点及其对基因水平转移的作用,研究并正确评估每一个环节的作用特点,是掌握blaKPC-2在中国快速播散的机制,找到正确控制blaKPC-2致碳青霉烯类耐药的基础,为改进或建立新的控制耐药菌播散模式提供可靠的理论基础,对医院感染的监控与治疗具有较大的意义。第一部分碳青霉烯酶KPC酶和膜孔蛋白OmpK35与OmpK36谁是导致肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药的主要原因目的：判定临床分离的产2型碳氢酶烯酶的肺炎克雷伯菌分离株中,β内酰胺酶和OmpK35与OmpK36蛋白谁才是导致细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。方法：连续收集57株非重复的耐碳氢酶烯类的肺炎克雷伯菌分离株,首先采用等电聚焦电泳初步分析细菌产生p内酰胺酶的情况,再用PCR,基因测序进一步确认,MLST法分析细菌的基因型别。然后选择6株产生KPC酶的代表性分离株,采用qRT-PCR和蛋白电泳分析外膜蛋白的表达,PCR及PCR产物测序进一步分析外膜蛋白的表达及功能,将外膜蛋白缺陷的菌株与外膜蛋白完整的菌株组成配对组,采用λ-Red重组法敲除blaKPC-2基因,比较两组细菌及其在敲除blaKPC-2基因前后对碳青霉烯类的MICs,以研究KPC酶及外膜蛋白OmpK.35与OmpK36在肺炎克雷伯菌临床分离株对碳青霉烯类耐药中的作用。结果：57株分离株共有4种MLST基因型,其中50株ST11型,5株ST423型,1株ST65型,有一株属于新的MLST型别,ST977型。全部的6株代表性分离株均产生β内酰胺酶KPC-2, TEM-1和CTX-M-14,分离株XJ-3和XJ-5还分别携带blaDHA-1和blaVIM-1。在分离株XJ-1中,qRT-PCR和蛋白电泳均显示OmpK35和OmpK36蛋白表达明显下降,XJ-3和XJ-6分离株的ompK36基因突变导致功能缺陷性,分离株XJ-2、XJ-4和XJ-5的OmpK35和Ompk36的表达和功能正常。药敏结果显示,外膜蛋白低表达或缺陷的菌株XJ-1、XJ-3和XJ-6对碳青霉烯类的MICs高(>32 mg/L),而外膜蛋白表达和功能正常的菌株XJ-2、XJ-4和XJ-6对碳青霉烯类的MICs相对较低(2-4 mg/L),结果显示外膜蛋白OmpK35和Ompk36在野生菌株对碳青霉烯类的耐用中有重要作用。敲除blaKPC-2基因后,分离株XJ-1和XJ-4对亚胺培南,美罗培南和厄他培南的MICs值都产生了8倍的下降,产生AmpC酶或其他种类碳青霉烯酶的分离株XJ-3和XJ-5,对碳青霉烯类的MICs则仍大幅降低。结果显示敲除blaKPC-2基因的试验菌株对碳青霉烯类的耐药似乎与外膜蛋白OmpK35和Ompk36是否正常无关。结论：综合上述实验结果,我们认为临床肺炎克雷伯菌株对碳青霉烯的耐药中,是否产生碳青霉烯酶或其他β-内酰胺酶是主导因素,外膜蛋白OmpK35和OmpK36缺陷是辅助因素。第二部分转座子和质粒对碳青霉烯酶基因blaKPC-2在肠杆菌科细菌中水平播散的作用研究目的：通过研究华山医院blaKPC-2初现到爆发时间段内108株产2型碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌分离株完整的blaKPC-2基因周围DNA序列及重要质粒的全序列,了解blaKPC-2基因在肠杆菌科细菌细胞内及菌细菌间的运动模式。方法：收集华山医院blaKPC-2初现到爆发时间段内108株携带KPC-2型碳青霉烯酶肠杆菌科细菌分离株。采用K-B纸片扩散法检测受试菌株对21种抗菌药物的敏感性,采用PCR扩增和测序检测碳青霉烯酶基因,PCR mapping测定耐药基因周围环境和转座子结构,利用MLST分型技术对菌株间的同源性进行分析,通过接合实验、质粒提取、Southem杂交等方法确定耐药基因的定位的质粒,鸟枪法测序测定携带耐药基因的质粒序列,并通过生物信息学方法分析基因结构。结果：所有菌株均携带blaKPC-2基因,blaKPC-2基因位于结构不同的Tnl721-Tn3样转座子上,包括完整的Tn1721、Tn1721-Tn3样转座子及Tn1721-IS26复合转座子,本批研究菌株中,出现最多的Tn1721-IS26复合转座子(72/108)。携带blaPC-2基因的转座子可在不同类型的质粒间移动,接合性质粒则是运载blaKPC-2基因在不同MLST型别的肠杆菌科细菌及不同种类细菌间播散的工具。质粒分型最初分离到的携带blaKPC-2的质粒以及随后两年散发发现的blaKPC-2阳性质粒均为P31型,而导致blaKPC-2爆发的质粒为F12型。结论：携带blaKPC-2基因耐药菌株已经在国内医院广泛流行,该基因最常位于Tn1721-IS26复合转座子上,可通过不同型别的可接合质粒接合转移,很好地揭示了国内blaKPC-2基因的水平播散传播途径。第三部分转座子Tn1721同时含有质粒介导磷霉素耐药基因fosA3和碳氢酶烯酶基因blaKPC-2为理解肠杆菌科分离株对碳氢酶烯酶耐药和磷霉素耐药的遗传学背景和播散机制,研究了一株临床大肠杆菌分离株HS102707,一株临床产气肠杆菌分离株HS112625,两株分离株均对磷霉素耐药,亚胺培南中敏,blaKPC-2和fosA3基因均阳性,此外,一株碳氢酶烯耐药但磷霉素敏感的临床肺炎克雷伯杆菌分离株HS092839也被列入研究。通过接合试验,一个70kb的质粒被成功转移到受体菌大肠杆菌J53中。PCR和Southern blot试验证实了blaKPC-2基因存在于此质粒上。pHS102707全序列测序显示质粒含有一个复制基因trfA,parA和parB等几个质粒稳定性基因,一套毒素抗毒素系统蛋白基因higA和higB,抗限制内切酶基因klcA和klcB,两套Ⅳ型分泌系统。在复制蛋白基因trfA的3’末端的质粒稳定模块中插入了一个携带blaKPC-2基因的Tn1721-Tn3样复合转座子。在pHS 102707和pHS112625中,一个含有fosA3基因的复合转座子IS26插入在Tn1721-tnpA基因中,导致Tn1721-tnpA基因的破坏,和Tn1721-tnpR基因的缺失。然而,在pHS092839,仅有IS26复合转座子和缩短了的Tn21-tnpR基因插入在相同的位置。fosA3和blaKPC-2共存在于同一个转座子中,而含有这个转座子的质粒具有高稳定性和高接合能力。此次研究表明需对这种blaKPC-2和fosA3的传播方式进行严格监控。