前言：先天性肛门直肠畸形(Anorectal Malformations,ARMs)是最常见的小儿消化道畸形,是世界卫生组织常规监测的先天畸形之一,占消化道畸形的1/4,发病率为1/5000～1/1500。尽管长期以来对肛门直肠畸形的手术方式的不断改进及术后监护水平的不断提高,其总体预后得到了明显改善。但长期随访发现,仍有许多中高位肛门直肠畸形患儿术后存在不同程度的排便功能障碍,严重影响患儿的生理及心理健康。术后肛门直肠功能不良取决于许多因素,诸如盆底神经肌肉发育异常、肠神经系统发育障碍、骶尾椎畸形等等。而盆底肌作为控制排便功能的关键元素,其发育程度无疑是决定术后排便功能最重要的因素之一。　　 大量临床研究及前期动物实验均已发现,中高位肛门直肠畸形伴有不同程度的盆底肌发育异常,是导致术后排便功能障碍的主要原因。但迄今为止,肛门直肠畸形盆底肌胚胎异常发育机制尚不清楚,也缺乏有效地、有针对性的治疗方法。　　 凋亡在胚胎发育及维持组织稳定等各种生理过程中起关键作用,也参与多种病理过程。在骨骼肌的不同发育阶段,如原始肌团分离形成各组肌肉、神经肌肉接头形成、不同类型肌纤维比例改变及肌肉塑形重建过程中均有凋亡的参与。研究发现,在肛门直肠畸形胚胎尾肠退化、尿直肠隔与泄殖腔膜融合及肛膜破裂时均存在异常凋亡现象。在正常盆底肌胚胎发育过程中是否有凋亡的参与,凋亡在肛门直肠畸形盆底肌异常发育过程中是否也起作用目前尚不得而知。　　 随着分子生物学的研究进展以及细胞示踪技术的应用,已初步阐明骨骼肌胚胎发育的发生机制。脊椎动物的骨骼肌起源于体节,体节来源的生肌祖细胞在周围信号因子的作用下启动生肌程序。而位于肢体水平的体节,其生皮肌节侧缘去上皮化,生肌祖细胞分离形成单个细胞,在各种趋化因子的引导下,向远处移行。到达靶定部位后,在局部信号作用下,激活肌特异性基因,表达生肌调节因子,启动肌细胞分化增殖,形成骨骼肌原始肌纤维。在胚胎发育晚期,基底膜形成以后,部分生肌祖细胞定植于基底膜与肌纤维膜之间转化形成卫星细胞,保持不分裂、静止状态。骨骼肌的发育成熟是在原始肌纤维基础上,通过卫星细胞活化增殖并启动成肌过程,同原有的骨骼肌细胞相互融合,或是彼此融合,形成新的骨骼肌纤维。作为骨骼肌的专性干细胞,卫星细胞在正常盆底肌的胚胎动态发育过程如何;在肛门直肠畸形盆底肌异常发育时是否也存在卫星细胞发育缺陷;干细胞赖以生存并为其提供各种支持的微环境发育情况,目前在国内外文献中均未见报道。　　 当前对排便功能障碍的治疗主要局限于功能刺激生物反馈及周围肌肉转移替代治疗方面,通过改变肛管直肠角或建立神经反射弧等来促进排便控制,没有从根本上解决盆底肌发育不良问题。虽然取得了一定的近期疗效,但长期随访发现并不能达到满意的控制排便功能。骨骼肌卫星细胞作为骨骼肌专性干细胞,具有在体内或体外分化成肌的能力,已经越来越多地被应用于基础实验及临床研究,在缺血心肌再生、膈肌重建及膀胱括约肌重建等方面取得了成功。应用卫星细胞移植治疗盆底肌发育不良有望成为改善肛门直肠畸形术后排便功能极具前景的治疗策略。　　 本文应用乙烯硫脲(ethylenethiourea,ETU)致畸建立的Wistar大鼠ARMs动物模型,研究正常胎鼠及肛门直肠畸形胎鼠盆底肌胚胎发育过程中的细胞凋亡,以及Bcl-2/Bax时空表达差异;同时研究正常胎鼠及肛门直肠畸形胎鼠盆底肌卫星细胞及其微环境的胚胎动态发育,分别从细胞凋亡及干细胞水平探索肛门直肠畸形盆底肌异常发育潜在机制。另外通过提取骨骼肌卫星细胞经过体外培养增殖,绿色荧光蛋白标记后种植入经物理化学方法建立的横纹肌复合体去细胞支架内,移植入盆底后观察在体内分化形成骨骼肌情况,探索卫星细胞移植治疗肛门直肠畸形盆底肌发育不良的可行性。　　 实验材料：　　 1.实验动物　　 体重250～300克的Wistar大白鼠,体重80-100克Wistar公鼠由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。　　 2.实验试剂　　 ①乙烯硫脲Ethylenethiourea,ETU(购自德国Sigma-Aldrich公司)；　　 ②TUNEL试剂盒(购自德国Roche公司)；　　 ③Bcl-2/Bax抗体、Myogenin抗体及SYP抗体(购自美国Santa Cruz公司),Vimentin抗体、Neurofilament抗体、vWF抗体、Desmin抗体及Myosin抗体(购自美国Lab Vision公司),Laminin抗体(购自英国Abcam公司),MyoD抗体(购自美国BD公司),Pax7抗体(购自美国R&D公司),GFP抗体(购自美国Chemicon公司)；　　 ④山羊抗小鼠IgG-TRITC(购自美国Chemicon公司),山羊抗兔IgG-Alexa Fluor488(购自美国Invitrogen公司),免疫组化超敏试剂盒(购自福州迈新生物技术开发有限公司),二步法山羊免疫组化检测试剂盒(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)；　　 ⑤eGFP腺病毒(购自北京诺赛基因组研究中心有限公司)；　　 ⑥bFGF(购自英国Pepro公司),鼠尾胶原(购自杭州生友生物技术有限公司),Ⅰ型胶原酶(购自德国Sigma-Aldrich公司),胰酶(购自美国HyClone公司),胎牛血清(购自美国GIBCO公司),Ham's F10培养基(购自美国GIBCO公司)；　　 ⑦逆转录试剂盒(购自大连宝生物工程有限公司)。　　 实验方法：　　 1.动物模型制备及病理切片Wistar孕鼠于妊娠第10天(E10),按125mg/kg经胃管给予1％ETU,制作ARMs大鼠动物模型,对照组给予等量的生理盐水。妊娠第16-21天剖宫取胎,尾部躯干经4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定,常规脱水、石蜡包埋,进行矢状面、横断面或冠状面连续切片。　　 2.盆底肌胚胎发育过程中的细胞凋亡研究应用TUNEL染色、DNA ladder方法研究正常胎鼠及肛门直肠畸形胎鼠盆底肌发育过程中的细胞凋亡现象。同时通过Bcl-2/Bax的免疫组织化学染色及RT-PCR方法,研究Bcl-2/Bax在盆底肌胚胎发育过程中的时空表达,探索其对盆底肌凋亡的可能调控作用。　　 3.盆底肌卫星细胞及其微环境的胚胎发育研究应用免疫荧光化学染色及real-time PCR技术,研究正常胎鼠及肛门直肠畸形胎鼠盆底肌卫星细胞胚胎动态发育,并且对卫星细胞进行超微结构分析、卫星细胞分离培养及分化能力的鉴定。通过对vWF、Neurofilament、Vimentin蛋白进行免疫荧光化学染色,研究卫星细胞微环境的胚胎发育,从干细胞水平探索盆底肌异常发育的可能发生机制。　　 4.成肌细胞移植重建盆底横纹肌复合体提取肌卫星细胞进行体外培养分化形成成肌细胞,应用免疫荧光染色及流式细胞技术鉴定,经携带eGFP的腺病毒转染后,移植入经过物理化学方法处理建立的横纹肌复合体去细胞支架中,带细胞支架移植回体内4周后检测其在体内分化形成骨骼肌情况,初步探索成肌细胞移植治疗盆底肌发育不良的可行性。　　 5.结果统计分析所有数据均以(x-)±s表示,差异比较采用SPSS13.0统计软件进行各胎龄正常组与ARMs组的t检验或单因素方差分析,P＜0.05表示差异有统计学意义。　　 结果：　　 1.肛门直肠畸形盆底肌发育过程中的细胞凋亡模式改变正常胎鼠16天时,盆底横纹肌复合体未见明显的TUNEL阳性凋亡细胞,孕17天以后出现的零星阳性细胞主要集中在横纹肌复合体与球海绵体肌交界区及直肠后两侧横纹肌复合体汇合处。肛门直肠畸形胎鼠,TUNEL阳性细胞在孕16天时就非常明显,大量的阳性细胞主要分布在横纹肌复合体的背侧。两组间各孕龄组凋亡指数差异具有统计学意义。DNA ladder结果显示畸形组条带更加明显。　　 2.Bcl-2/Bax的时空表达差异免疫组织化学染色及RT-PCR结果表明,E16时未见明显的Bcl-2/Bax的表达,E17后Bcl-2/Bax的表达逐渐增强。与正常组比较,肛门直肠畸形大鼠盆底肌存在Bcl-2/Bax的时空表达异常,Bcl-2表达明显下调,分别为0.44±0.06 vs.0.49±0.07(17天),0.69±0.09 vs.0.90±0.14(19天),0.51±0.07 vs.0.71±0.11(21天),孕19及21天时有显著性差异。而Bax基因表达上调,分别为0.39±0.04 vs.0.31±0.03(17天),0.47±0.05 vs.0.37±0.04(19天),0.40±0.05 vs.0.37±0.05(21天),孕17及19天时差异有显著性意义。　　 3.盆底肌卫星细胞胚胎动态发育过程异常对Myogenin及Pax7的定性及定量研究发现,正常胎鼠16天时盆底肌已有Myogenin阳性表达,随着胎龄增加,Myogenin表达逐渐增强;孕17天以后出现Pax7阳性的卫星细胞,孕19天阳性率最高,孕21天时有时下降。而肛门直肠畸形胎鼠盆底肌Myogenin表达明显减弱,胚胎晚期差异愈发明显;孕16天时即有较强的Pax7阳性表达,孕17天后表达增强,与正常组比较,Pax7阳性细胞比例明显增加。　　 4.卫星细胞超微结构变化透射电镜扫描提示正常组盆底肌肌纤维排列规则,肌横纹明显;卫星细胞位于基底膜与肌浆膜之间,细胞规则,核浆比例较高,胞核呈椭圆形;胞膜与肌浆膜紧密接触,被薄薄的基底膜共同包绕。肛门直肠畸形盆底肌肌纤维排列紊乱,肌横纹不明显;卫星细胞细胞核形态不规则、异染色质增多;卫星细胞与肌细胞间的细胞间隙增大,基底膜明显增厚。　　 5.肛门直肠畸形盆底肌卫星细胞分化障碍从胎鼠盆底肌提取的卫星细胞经体外培养后进行细胞分化能力鉴定,培养24小时后,两组细胞均表现出MyoD/Myogenin阳性表达;培养72小时后,正常组细胞MyoD表达明显下降(11.83％),而畸形组细胞仍有较高比例的MyoD表达(35.28％);培养120h后正常组细胞每个视野下可见到平均10个Myosin阳性的多核肌管形成,而畸形组Myosin阳性细胞明显减少,两组间具有显著差异。　　 6.肛门直肠畸形时盆底肌卫星细胞微环境发育缺陷免疫荧光化学染色显示在正常组中,vWF表达明显,在SMC横断面上呈均匀分布,可见较多Neurofilament阳性表达的神经纤维,肌束之间可见少量Vimentin阳性表达。而在ARMs组,vWF表达较弱,多分布在横纹肌复合体的周边,Neurofilament的表达极其微弱,几乎在每根肌束周围都可见Vimentin阳性表达的纤维组织。　　 7.分离培养的卫星细胞存在两个不同的亚群贴壁较早的细胞增殖速度较快,传代能力有限,很快分化融合成多核肌管;而晚贴壁细胞中有较多呈球形或短梭形的细胞,该群细胞有较高的核浆比例,表达卫星细胞特异性标记Pax7,保持干细胞或类似干细胞状态,其增殖速度慢,传代次数相对较多。随着培养时间延长,晚贴壁细胞中仍有较高比例的短梭形细胞存在。　　 8.提取培养的卫星细胞在体外具有分化成肌能力卫星细胞体外培养后能分化形成Desmin染色阳性的成肌细胞,并融合形成Myosin阳性的多核肌管,分化培养基中培养1周后在倒装显微镜下可以见到肌纤维的自主收缩。　　 9.移植的成肌细胞在体内分化形成肌纤维携带成肌细胞的横纹肌复合体支架移植入体内后分化形成肌团,免疫荧光染色提示Myosin及GFP双重表达阳性,在肌纤维周围可见vWF阳性染色的血管内皮细胞,肌纤维膜下可见Pax7阳性染色细胞,占据卫星细胞位置。　　 结论：　　 1.凋亡在正常横纹肌复合体胚胎发育过程中起重要作用;异常凋亡可能是肛门直肠畸形时横纹肌复合体发育不良的基本病理过程;Bcl-2/Bax的时空表达仍然是调节横纹肌复合体凋亡的重要因子。　　 2.过早形成了卫星细胞使得形成肌纤维的成肌细胞减少,同时卫星细胞超微结构异常、分化功能障碍,并且存在微环境的发育缺陷,上述因素协同作用可能是导致肛门直肠畸形盆底肌发育不良的原因之一。　　 3.卫星细胞在体内体外均具有较强的生肌潜能,经体外分离培养分化形成成肌细胞后移植至盆底能分化形成肌纤维,可以作为修复发育不良盆底肌的细胞来源。