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目的:胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme,GBM）是侵袭性最强、最难治愈的恶性肿瘤之一,占原发性脑肿瘤的52%,5年病死率仅次于胰腺癌和肺癌位居全身恶性肿瘤的第3位,严重威胁人类健康。因此,对其发病机制和治疗策略的研究具有重要意义。目前治疗方法包括手术切除、放疗、全身治疗（基于替莫唑胺的化疗、靶向治疗）和支持性治疗等。然而,即使采用这种多模式联合治疗策略,患者平均生存时间仅有14.6个月。替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）的低效性和耐药性是胶质母细胞瘤复发和死亡的重要原因。因此,深入探讨胶质母细胞瘤发生发展及耐药分子机制,在此基础上开发精准治疗新方法和新策略势在必行。中心体蛋白55（CEP55）是中心体相关蛋白以及胞质分裂的关键调节因子,参与细胞周期的调控。本项目组既往研究发现,星形细胞瘤中普遍存在CEP55异常表达,其表达水平随肿瘤级别升高而增加,且CEP55高表达患者生存期较短。本课题拟在已有研究基础上,通过生物信息学预测及临床样本观察,发现CEP55表达水平与胶质母细胞瘤患者TMZ敏感性的关系,通过体内、体外实验初步探讨胶质母细胞瘤中CEP55通过结合YB-1影响TMZ敏感性的可能机制,为阐明胶质母细胞瘤TMZ耐药的分子机制,优化治疗分子干预策略奠定研究基础。方法:1.使用GEPIA网站分析癌症基因图谱库TCGA（The Cancer Genome Atlas）胶质瘤CEP55的表达情况,在中国胶质瘤基因图谱库CGGA（Chinese Glioma Genome Atlas）数据库中进行验证,并在线分析其与临床病理特征及预后之间的关系。2.收集河北医科大学第二医院2009年1月至2019年1月246例胶质瘤石蜡组织标本（依照2016版WHO分级,包括2级星形细胞瘤81例;3级间变型星形细胞瘤89例;4级胶质母细胞瘤76例）。免疫组织化学染色检测石蜡组织中CEP55表达水平并分析其与临床病理特征之间的关系;收集行MGMT甲基化检测胶质母细胞瘤病例28例,以是否具有MGMT启动子甲基化将GBM患者分为TMZ敏感组及不敏感组,分析CEP55与TMZ敏感性的关系。同时收集12对新鲜手术标本（术后病理诊断证实为胶质母细胞瘤）,Western Blot方法检测CEP55在肿瘤组织及瘤旁组织中的表达。3.体外培养GBM细胞株U87和U251,si RNA技术沉默CEP55,以不同浓度TMZ处理各组细胞,CCK-8、检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期变化、q PCR及Western Blot观察细胞周期关键因子Cdc2,Cdc25c,P27,Cyclin D1,Cyclin B表达变化。4.60例胶质母细胞瘤石蜡组织标本、胶质母细胞瘤冰冻组织标本,行免疫荧光染色及免疫荧光染色,分析CEP55与YB-1表达的相关性。采用免疫共沉淀方法检测CEP55与YB-1在胶质母细胞瘤中共表达情况。结果:1胶质母细胞瘤CEP55高表达与临床病理特征的关系1.1 CEPP55在胶质母细胞瘤高表达1.1.1通过TCGA和CGGA数据库分析胶质瘤中CEP55在m RNA水平上表达明显高于非肿瘤脑组织。胶质母细胞瘤CEP55表达水平明显高于低级别胶质瘤。CGGA数据库观察不同组织学类型的胶质瘤以胶质母细胞瘤亚型CEP55表达水平最高（包括经典型胶质母细胞瘤,上皮样胶质母细胞瘤,小细胞胶质母细胞瘤）。1.1.2收集12对新鲜手术标本（肿瘤组织及瘤旁组织）,术后病理证实为胶质母细胞瘤,Western Blot方法检测CEP55蛋白水平的表达情况,其中11对病例肿瘤组织中CEP55表达水平明显高于瘤旁组织。1.2 CEP55高表达的临床病理意义1.2.1 CEP55高表达与临床病理特征之间的关系通过CGGA数据库在线分析发现,与对照组相比,IDH1野生型、无1p/19q共缺失、放化疗抵抗和复发胶质瘤组织样本中高表达CEP55。1.2.2 CEP55表达水平与胶质瘤预后之间的关系TCGA和CGGA数据库Kaplan-Meier生存曲线均提示,高表达CEP55患者生存期较短。CGGA数据库在线Cox比例风险回归模型进行单因素和多因素分析提示CEP55、复发、WHO分级,及IDH、1p/19q状态是独立的预后因子。河北医大二院246例星形细胞瘤样本进行单因素和多因素Cox回归分析,结果显示,CEP55表达水平、WHO分级及年龄是独立的预后因子。2 CEP55影响胶质母细胞瘤TMZ敏感性2.1以MGMT启动子甲基化为TMZ敏感的标志分为不敏感组（MGMTu）11例和敏感组（MGMTm）17例,免疫组织化学方法检测胶质母细胞瘤中CEP55表达水平,结果显示TMZ不敏感组患者的CEP55表达水平明显高于TMZ敏感组。2.2利用GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）基因富集分析对CEP55和cell cycle、G2/M checkpoint相互作用进行预测,CEP55高表达cell cycle、G2/M checkpoint基因组均有差异富集。2.3 si RNA技术沉默GBM细胞CEP55,CCK-8实验观察GBM细胞增殖数目减少。流式细胞结果提示沉默CEP55细胞阻滞在G2/M期。采用q PCR和WB的方法检测细胞周期关键分子,结果显示G2/M期转化关键因子Cyclin B降低。3 CEP55可能通过与YB-1结合从而影响TMZ敏感性3.1通过Gene Ontology（GO）生物信息库进在线预测CEP55互作基因,按相关系数前10位与CEP55相关基因,按相关性依次为YBX-1,TP53,NCAPG,MELK,AURKA,DLGAPS,BUB1,TPX2,KIF4A,CDCAS。选取相关系数最高的基因通过TCGA数据库进行验证,提示CEP55与YB-1呈正相关关系,相关系数为0.593。3.2采用免疫荧光方法检测胶质母细胞瘤中CEP55与YB-1表达情况,结果显示CP55（绿色荧光）与YB-1（红色荧光）在胶质母细胞瘤胞质中处于共定位状态。3.3 U87和U251细胞分别沉默CEP55、YB-1,采用q PCR方法检测YB-1及CEP55表达水平,U251细胞沉默CEP55,YB-1表达水平降低,沉默YB-1,CEP55表达水平降低。3.4运用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CO-IP）法探究CEP55与YB-1之间的关系,结果提示CEP55与YB-1在胶质母细胞瘤存在相互作用关系。3.5运用免疫组织化学方法对60例胶质母细胞瘤石蜡组织行CEP55和YB-1染色,并进行相关性分析,结果提示两者存在正相关关系r=0.255,P=0.049。结论:1.胶质母细胞瘤CEP55表达水平与替莫唑胺药物敏感性相关2.GBM细胞沉默CEP55其增殖能力降低,可能通过G2/M期阻滞影响TMZ敏感性3.CEP55可能通过与YB-1相互作用并发挥一定生物学功能。