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骨质疏松症(Osteoporosis)是骨骼系统的一种多基因复杂疾病,以骨量减少、骨的微观结构退化为特征,致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的全身性骨骼疾病。骨质疏松症用骨密度来定义,骨密度的遗传力大约为60%-80%。全基因组关联研究(Genome-wide association studies,GWAS)是鉴别常见复杂疾病(性状)易感基因的有力工具,至2015年5月,共有25篇骨质疏松症(骨密度)的GWAS文章发表,报道P<5×10-8的关联基因107个,关联单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)129个,未来的挑战就是理解这些基因和SNP的功能及作用机制。本研究的目的之一是对骨质疏松症GWAS关联SNP及基因进行计算分析和功能预测。我们的蛋白互作分析鉴定SOST是一个hub基因,我们先前发现SOST基因上游的顺式调节多态rs1230399(T/C)与骨密度显著关联,且计算分析表明rs1230399多态影响转录因子FOXA1的结合,本研究的另一个目的就是对rs1230399多态进行功能研究,揭示rs1230399通过影响FOXA1与其结合,进而调节SOST表达的分子机制。1.骨质疏松症GWAS关联SNP和基因的计算分析。①骨质疏松症GWAS关联SNP的保守性分析。通过VISTA和UCSC网络数据库预测得到保守性的 SNP 有 9 个,分别为 rs7741021、rs4355801、rs7071206、rs227425、rs9287237、rs2952559、rs3801387、rs4233949 和 rs9533095。②骨质疏松症 GWAS 关联 SNP 的 RegulomeDB功能注释。GWAS SNP及其porxy SNP的RegulomeDB分值小于3的有119个,它们具有潜在的调节功能;一些骨质疏松症GWAS关联SNP是骨代谢相关基因FGFRL1、TNFRSF11B、LIN7C ALDH7A1和C6orf97的eQTL;RegulomeDB同时还揭示一些SNP位于骨代谢相关转录因子MEF2A、MEF2C、STAT3、THAP1、FOXA1、NFATC1、ESR1 和 NFIC 等的结合位点。③骨质疏松症GWAS关联SNP的lncRNA分析。lncRNASNP分析发现lead SNP rs6894139位于lnc-RASA1-7,影响其与 miR-369-3p 和 miR-8084 的结合:proxy SNP rs3806641和 rs1467561 分别位于lnc-NAA50-1和lnc-CKB-1,其中rs3806641可影响miR-6704与lnc-NAA50-1的结合。④骨质疏松症GWAS关联SNP的远距离互作分析。GWAS3D分析表明rs1463104、rs4729260和rs2887571具有显著的远距离调控信号,可能与其它相关位点存在远距离调控。⑤GWAS关联SNP 对 miRNA-mRNA 互作的影响分析。129 个 GWAS Lead SNP 中 rs884205 和 rs1026364 可能影响miRNA与mRNA的结合,而2062个proxy SNP中有14个可能影响miRNA-mRNA互作。⑥GWAS关联SNP对蛋白磷酸化的影响。3个GWAS Lead SNP(rs3755955,rs2707466,rs3736228)和 3 个proxy SNP(rs9866806,rs6831280,rs10416218)可能影响蛋白质的磷酸化。⑦骨质疏松症GWAS关联基因的GO分析。PANTHER的GO富集分析表明,骨质疏松症GWAS关联基因主要与细胞成分、胞外区域、胞外基质、细胞器、大分子复合物和细胞膜等细胞组分有关,并主要富集到代谢过程、细胞过程、生物调节和发育过程等生物学过程及结合、催化活性、受体活性和核酸与转录因子结合活性等分子功能。David分析发现富集的GO类别有23个生物学过程,4个分子功能和4个细胞组分。⑧骨质疏松症GWAS关联基因的信号通路富集分析。利用David工具KEGG数据库分析骨质疏松症易感基因的信号通路,发现显著富集(P<0.01)的 KEGG信号途径有Wnt signaling pathway、Basal cell carcinoma和 Hedgehog signaling pathway。⑨骨质疏松症GWAS关联基因的蛋白互作网络分析。用STRING进行蛋白互作网络分析,鉴定了一些重要的 hub 蛋白:RUNX2、SP7、TNFRSF11B、LRP5、ESR1、SOST 和 DKK1。2.rs1230399的功能研究①rs1230399的功能分析。将构建好的rs1230399-T和rs1230399-C载体转染293T、Saos-2和U2-OS细胞,双荧光素酶报告基因检测结果显示:与C重组载体相比,T重组载体荧光素酶活性明显下降(P<0.001),表明rs1230399的两个等位基因活性有差异,可影响转录因子或者DNA结合蛋白的结合。计算分析表明rs1230399等位基因由C突变为T时,转录因子FOXA1可与之进行结合。我们构建FOXA1干扰载体和过表达载体并转染细胞检测荧光素酶活性,发现FOXA1.shRNA转染293T和Saos-2细胞后,rs1230399-T+FOXA1.shRNA荧光素酶报告基因活性显著高于rs1230399-C+FOXA1.shRNA组和rs1230399-T组的荧光素酶活性;共转染FOXA1过表达载体与rs1230399重组载体后发现,三种细胞中rs1230399-T+FOXA1过表达组荧光素酶报告基因活性显著低于rs1230399-C+FOXA1过表达组的荧光素酶活性,表明rs1230399等位基因的改变的确影响了转录因子FOXA1结合,且rs1230399为T时结合能力增强。生物素标记的Pull down实验结果同样表明,带有T等位基因的探针与FOXA1抗体结合较强,带有C等位基因的探针与FOXA1抗体结合较弱。②FOXA1对SOST基因表达的影响。FOXA1被敲降后SOSTmRNA和蛋白的表达显著升高;FOXA1过表达后SOSTmRNA和蛋白的表达则显著降低,表明FOXA1可调节SOST基因表达。③激素对FOXA1基因表达的影响。用10nM的雌激素刺激293T细胞15h,WB检测发现FOXA1表达略微上调,而50 nM甲状旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)刺激293T细胞16h开始FOXA1的表达则明显上调,表明雌激素和PTH可以促进FOXA1基因的表达。这些结果表明rs1230399(长距离的增强子多态性)可能通过影响FOXA1(受激素调控的转录因子)的结合来调节SOST基因的表达进而影响骨密度的新机制。