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研究目的1-溴丙烷(1-bromopropane,1-BP)作为一种臭氧层消耗溶剂如氯氟烃类和某些致癌物如三氯乙烯、三氯甲烷、四氯乙烯的替代剂而广泛地应用于工作场所中,主要用途是作为金属、电子元件、光学仪器的清洗剂等。研究显示1-BP能导致健康损伤,呈现周围神经系统(peripheral nervous system, PNS)毒性如导致感觉和运动损伤以及中枢神经系统(central nervous system, CNS)毒性如引起抑郁、焦虑和认知损伤。1-BP中毒病例从1999年至今在美国、日本等地陆续报道,与其它的神经毒性有机溶剂如正己烷导致的神经中毒病例相比,1-BP中毒病人更多地表现出CNS毒性症状。迄今为止,1-BP导致CNS损伤的初始靶点和早期关键事件尚未明确。研究显示在人类慢性神经退行性疾病的起始和进展过程中,病变大脑中持续存在着逐渐加重的慢性炎症反应,被认为与退行性病变的发生发展密切相关。在环境神经毒物诱导损伤实验动物的大脑中也观察到明显的炎性变化。星形胶质细胞(astrocyte, AS)作为大脑内炎性反应的主要介导者,其功能失调在神经炎症反应中的关键作用受到越来越广泛的关注。但炎性反应是否是1-BP的主要神经毒性机制尚未见报道。近年来的研究显示,二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)具有很强的抗炎活性,且能穿越血脑屏障,膳食补充DHA能够明显提高大脑中DHA水平,如若补充DHA能够减轻1-BP的神经毒性反应可提示1-BP的神经毒性与脑内的炎性反应相关。同时,吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(ammonium pyrrolidinedithiocarbamate, PDTC)是炎性通路中关键信号分子核转录因子-κB(nuclear transcription factor κB, NF-κB)的特异性抑制剂,抑制NF-κB激活、阻断炎性反应若能够有效逆转1-BP的神经毒性,可证实炎性反应在1-BP神经毒性机制中的作用。因此,本研究采用经口染毒途径,首先观察了1-BP对雄性Wistar大鼠大脑神经元损伤以及脑内炎性变化的剂量效应关系；进而分别采用具有抗炎作用的DHA和NF-κB阻断剂,观察了对1-BP导致神经元损伤的逆转情况,从炎症角度来评价1-BP的CNS毒性及其毒性机制,以期为1-BP以及其它有机溶剂神经毒性的防控及有效治疗提供理论参考依据。研究方法11-BP致大鼠大脑损伤的剂量效应关系60只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、100、200、400、800mg/kg·bw 1-BP剂量组,每组12只。动物适应性喂养5天后,将1-BP溶于玉米油,经口灌胃给予相应剂量的1-BP,对照组经口灌胃给予等体积的玉米油,每天1次,连续13天。病理形态学检测：每组随机选取4只动物麻醉后,行心脏灌注,制备大脑冰冻切片,分别进行免疫组化和TUNEL染色。免疫荧光双染色观察大鼠大脑前额叶皮质(prefrontal cortex, PFC)中神经元和AS的变化情况,TUNEL染色检测PFC中细胞的凋亡。Western blot:水迷宫实验结束次日晨,断头处死大鼠,迅速分离大鼠大脑PFC和海马(hippocampus, HPC),制备组织匀浆,15,000g、4℃离心30min。采用Western blot方法检测PFC中活化的caspase-3、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)和神经元核蛋白(neuron nuclear protein, NeuN)、糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)和蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)的蛋白含量变化。ROS含量测定：大鼠大脑PFC冰冻匀浆,采用二氯荧光素二乙酸作为荧光染料检测PFC中活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的含量。COX-2 mRNA含量测定：采用实时定量荧光PCR(quantitative real time PCR, qRT-PCR)检测大鼠大脑PFC中环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的mRNA含量。2补充DHA对1-BP神经毒性的影响神经行为学检测：60只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、1-BP组、1-BP+250mg/kg·bw DHA组和1-BP+500mg/kg·bw DHA组,每组15只,适应性饲养1周。1-BP溶于玉米油,经灌胃给予1-BP组、DHA干预组800mg/kg·bw的1-BP,每天1次,连续13天。DHA溶于玉米油,在1-BP染毒前7天经口灌胃分别给予250mg/kg·bw DHA组、500mg/kg·bw DHA组相应剂量的DHA,每天1次,连续20天。当DHA和1-BP需要共同给予时,DHA在1-BP染毒前4小时给予。对照组和1-BP组大鼠给予等体积的玉米油。定期测量大鼠体重,调整动物灌胃量,1-BP染毒后7天,所有实验动物进行水迷宫实验。病理形态学检测：每组随机选取4只动物麻醉后,行心脏灌注,制备石蜡切片,采用尼氏染色观察大鼠大脑PFC和HPC神经元损伤情况,TUNEL染色检测PFC和HPC中神经元凋亡。Western blot:水迷宫实验结束次日晨,断头处死大鼠,迅速分离大脑PFC和HPC,制备组织匀浆,15,000g、4℃离心30min。利用Western blot方法分别测定大鼠大脑PFC和HPC中凋亡相关蛋白,包括细胞色素C (cytochrome c, cyt c)、活化的caspase-3、Bcl-2和Bax；4-HNE和arcolein氧化蛋白加合物以及失活型的(即磷酸化的)GSK-3p和Akt蛋白含量的变化。3PDTC阻断NF-κB激活对1-BP炎性反应及神经毒性的影响神经行为学检测：48只Wistar大鼠随机分为对照组、800mg/kg·bw 1-BP组、100mg/kg·bw PDTC组、100mg/kg·bw PDTC+800mg/kg bw 1-BP组,1-BP溶于玉米油经口灌胃,PDTC溶于生理盐水提前1小时腹腔注射,对照组和PDTC组给予等体积的玉米油,每天1次,连续13天。1-BP染毒7天后,动物进行水迷宫实验。病理形态学检测：每组随机选取4只动物麻醉后,行心脏灌注,制备冰冻切片,免疫荧光双染色观察大鼠大脑PFC中神经元和AS的变化情况以及TUNEL染色检测PFC中细胞的凋亡。Western blot:水迷宫实验结束次日晨,断头处死大鼠,迅速分离大鼠大脑PFC,制备组织匀浆,15,000g、4℃离心30min。利用Western blot方法测定PFC中活化的caspase-3、GFAP、NeuN、GSK-3β和Akt的蛋白含量变化。ROS含量测定：大鼠大脑PFC冰冻匀浆,采用二氯荧光素二乙酸作为荧光染料检测PFC中ROS的含量。COX-2 mRNA含量测定：采用qRT-PCR测定大鼠大脑PFC中COX-2的mRNA含量。研究结果1 1-BP致大鼠大脑损伤的剂量效应关系1.1 1-BP染毒大鼠大脑PFC病理形态学改变与对照组相比,免疫荧光双染色显示1-BP组染毒大鼠大脑PFC中AS活化并伴随神经元减少；TUNEL染色显示大鼠大脑PFC中神经元凋亡增加,均表现为剂量效应。1.2 1-BP染毒大鼠大脑炎性反应的剂量效应关系与对照组相比,1-BP组染毒大鼠大脑PFC中ROS含量呈剂量依赖性升高(p<0.05)。1-BP染毒组大鼠大脑PFC中COX-2 mRNA含量也表现为剂量依赖性地升高(p<0.05)1.3 1-BP染毒大鼠PFC中各检测蛋白质的含量变化与对照组相比,1-BP组染毒大鼠活化的caspase-3和GFAP的蛋白表达量呈剂量依赖性升高(p<0.05),NeuN的蛋白表达量呈剂量依赖性降低(p<0.05),与免疫组织化学结果符合。实验结果显示,1-BP染毒大鼠大脑的p-GSK-3p和p-Akt的蛋白表达量均呈剂量依赖性升高(p<0.05)。2 补充DHA对1-BP神经毒性的影响2.1 补充DHA对1-BP染毒大鼠神经行为学的影响Morris水迷宫实验中,各组大鼠随着实验的进行其逃避潜伏期和游泳距离都呈下降趋势,下降趋势在各组间没有差别(p>0.05)。与对照组相比,1-BP组染毒大鼠的逃避潜伏期和游泳距离明显增加(p<0.05),而穿越平台的次数减少(p<0.01)。与1-BP染毒组相比,补充DHA后,1-BP染毒大鼠的逃避潜伏期和游泳距离明显降低,呈剂量依赖性(p<0.05),穿越平台次数增加(p<0.05)。实验结果显示,各组实验动物游泳速度没有明显差别(p>0.05),提示以上各种指标的差别非运动能力受损造成。2.2补充DHA对1-BP染毒大鼠大脑PFC和HPC病理形态学的影响在大鼠大脑PFC和HPC的CA3区,1-BP染毒导致神经元尼氏体密度降低,椎体细胞空泡化,而补充DHA能明显改善神经元的病理形态学变化。采用TUNEL染色检测大脑神经元的凋亡,结果显示对照组大鼠大脑几乎没有凋亡阳性细胞出现,而1-BP染毒大鼠大脑PFC和HPC的CA3区出现凋亡阳性细胞,补充DHA组大鼠神经元凋亡明显减少。2.3补充DHA对1-BP染毒大鼠大脑PFC和HPC中各检测蛋白质的影响与对照组相比,1-BP组染毒大鼠PFC和HPC中Bcl-2蛋白表达量显著下调(p<0.05),cyt c、Bax、活化caspase-3和Bax/Bcl-2的比例显著上调(p<0.05)磷酸化的GSK-3β(p-GSK-3β)和磷酸化的Akt (p-Akt)蛋白表达量显著升高(p<0.05),4-HNE和acrolein蛋白加合物表达量显著上升(p<0.05)。而与1-BP组相比,补充DHA后明显逆转了凋亡相关蛋白的表达；p-GSK-3β和p-Akt表达升高也得到纠正,4-HNE和acrolein蛋白加合物的含量亦明显降低(p<0.05)。3PDTC阻断NF-κB激活对1-BP炎性反应及神经毒性的影响3.1 PDTC阻断NF-κB激活对大鼠大脑PFC病理形态学的影响与对照组相比,1-BP组染毒大鼠大脑PFC中AS明显活化并伴随神经元的减少。TUNEL染色显示凋亡阳性细胞增多,而PDTC阻断NF-κB激活明显降低了AS活化、神经元减少以及神经元凋亡。3.2 PDTC阻断NF-κB激活对大鼠大脑PFC炎性反应的影响与1-BP相比,PDTC阻断NF-κB激活明显降低了大脑PFC中ROS的含量(p<0.05),同时PDTC阻断NF-κB激活后也明显降低了COX-2 mRNA的含量(p<0.05)。3.3 PDTC阻断NF-κB激活对大鼠大脑PFC中各检测蛋白质含量的影响与对照组相比,1-BP组染毒大鼠活化的caspase-3和GFAP的蛋白表达量显著升高(p<0.05),NeuN的蛋白表达量显著降低(p<0.05),p-GSK-3β和p-Akt的蛋白表达量显著升高p<0.05)。而与1-BP组相比,PDTC阻断NF-κB激活显著降低了大鼠大脑PFC中活化caspase-3和GFAP的蛋白表达量(p<0.05),增加了NeuN的蛋白表达量(p<0.05),降低了p-GSK-3β和p-Akt的蛋白表达量(p<0.05)3.4 PDTC阻断NF-κB激活对1-BP染毒大鼠神经行为学的影响Morris水迷宫实验中,各组大鼠随着实验的进行其逃避潜伏期和游泳距离都呈下降趋势,并且这种下降趋势组间没有差别(p>0.05)。与对照组相比,1-BP组染毒大鼠的逃避潜伏期和游泳距离增加(p<0.05),而穿越平台的次数减少(p<0.01)。与1-BP染毒组相比,PDTC阻断NF-κB激活,实验大鼠的逃避潜伏期和游泳距离(p<0.05)均明显缩短,穿越平台次数明显增加(p<0.05)。各组实验动物游泳速度没有明显差别(p>0.05),提示实验动物在Morris水迷宫实验中的差别并非由运动能力损伤导致。结论1.大脑是1-BP神经毒作用敏感的靶器官,1-BP可导致实验动物学习记忆相关区域神经元减少,动物认知功能障碍。2.1-BP导致的大脑损伤可能与大脑AS活化、脑内神经炎性反应及GSK-3β的失活有关。3.采用DHA和PDTC抑制脑内的炎性反应能够减轻1-BP的中枢神经毒性。