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原发性肝癌是目前全球发病率第六高、死亡率第四高的癌症。中国是肝癌大国,每年的肝癌发病人数与死亡人数约占世界的一半,严重地威胁人民的生活健康。肝癌的早期治疗主要包括肝切除术、肝移植术、局部消融治疗、肝动脉介入治疗、放射治疗和放射性核素免疫治疗等。但由于肝癌发现时通常为中晚期,仍然缺乏有效的治疗手段。目前常用的化疗药物索拉菲尼、瑞戈非尼等均为FDA通过的肝癌治疗药物,但不适用于所有肝癌患者,对延长病人的生存期十分有限,可能出现较严重的副作用,治疗效果不太理想。近年来有学者提出肿瘤干细胞学说:肿瘤干细胞是指具有干细胞性质的肿瘤细胞,拥有自我复制、多细胞分化和化疗药耐药等能力,有形成肿瘤,发展成癌症的潜力。学说认为肿瘤形成是一小部分肿瘤干细胞在肿瘤组织中无限增殖的结果。肝癌异质性强、容易复发的特点被认为与肝癌干细胞的上述特征密切相关。因此,清除肝癌中的肝癌干细胞可能是更有效治疗肝癌的策略。天然产物是新药的重要来源和药物开发的瑰宝。天然产物(+)-滇西八角醌(以下统称滇西八角醌)是本课题组从植物滇西八角中分离得到的一个新的蒽醌类化合物。前期研究发现滇西八角醌具有良好的抗肝癌细胞活性,对正常的肝脏细胞具有选择性。研究目的:本课题研究八角茴香科(Illiciaceae)八角属植物(Illicium Linn.)中的天然产物滇西八角醌的抗肝癌作用,并对其肝癌干细胞的抑制作用进行探究,探讨滇西八角醌治疗肝癌的靶标和机制。研究方法:(1)利用Oncomine、NCBI-GEO数据库等在线资源分析肝癌发生发展过程中信号通路的改变,寻找肝癌组织与正常肝组织之间的显著差异。(2)分离富集肝癌干细胞,研究滇西八角醌对肝癌干细胞的活性。利用CCK-8(Cell Counting Kit-8)实验、Spheres formation实验、Colony formation实验、蛋白质免疫印迹(Western Blot)实验和RT-PCR实验等方法,研究滇西八角醌对肝癌干细胞的自我更新、耐药和干性基因的改变等表型的影响。(3)利用DARTS(Drug affinity responsive target stability)联合高分辨质谱的label-free蛋白组学技术,对滇西八角醌作用于肝癌干细胞的靶标进行寻找,通过si RNA技术、CCK-8技术对筛选到的蛋白进行验证,确定滇西八角醌的候选靶标。(4)利用DARTS、CETSA(Cellular thermal shift assay)和分子对接等技术,确定滇西八角醌与靶蛋白的直接结合作用。构建稳转细胞株,检测靶蛋白与肝癌干细胞表型的关系,确定滇西八角醌的作用靶点。结果:分析数据集,找到肝癌进程中发生显著变化的89个差异基因(differential expression genes,DEGs)。对DEGs进行分析发现,PI3K/Akt signaling pathway、AMPK signaling pathway等多条通路与肝癌干细胞密切相关。CCK-8实验表明,滇西八角醌可以显著抑制肝癌干细胞的活性,对正常肝脏细胞没有明显作用,具有较好的选择性。通过Spheres formation、Colony formation实验,发现滇西八角醌可以明显抑制肝癌干细胞的自我更新和增殖,Western Blot和RT-PCR实验表明,滇西八角醌可以明显降低肝癌干细胞的干性基因的表达。利用DARTS联合高分辨质谱的Label-free蛋白质组学方法,发现滇西八角醌可能作用于GOT2(glutamic-oxaloacetic transaminase 2)、AIFM1(Apoptosis Inducing Factor Mitochondria Associated 1)等蛋白。si RNA技术联合CCK-8实验表明,将GOT2敲低后,滇西八角醌抑制肝癌干细胞的活性显著减弱,几乎失效。本研究通过DARTS、CETSA和分子对接技术,确定了滇西八角醌与GOT2的直接结合作用,滇西八角醌与GOT2结合后使GOT2的酶活增加。构建GOT2敲低和GOT2过表达的稳转细胞株,发现GOT2敲低后肝癌干细胞的干性基因表达升高、耐药性增强、自我更新增强,过表达后效果相反。证实了GOT2参与调控肝癌干细胞的表型。结论:本研究表明,肝癌发生过程中的信号通路改变与肝癌干细胞的特性密切相关。天然产物滇西八角醌可以明显抑制肝癌干细胞的活性,增加肝癌干细胞的凋亡。通过蛋白质组学、DARTS、CETSA、分子对接和稳转细胞株等实验技术及相关模型的构建,发现滇西八角醌可以靶向激活GOT2抑制肝癌干细胞的增殖。