【摘 要】
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拟穴青蟹是我国主要的经济养殖蟹类之一,广东省作为我国最大的青蟹养殖省份,养殖规模和养殖产量连年位居全国前列。已有研究表明,拟穴青蟹与其他无脊椎动物一样,其血淋巴中存在微生物,且相对稳态的血淋巴微生物数量和菌群结构对维持青蟹正常的生理状态至关重要。本研究结果表明:1、检测不同环境因子（氨氮、病毒、p H、盐度、温度、光照）应激条件下拟穴青蟹血淋巴中ROS含量变化,表明环境因子会显著影响青蟹血淋巴中R
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（No.41876152、No.31850410487）； 广东省自然科学基金项目（No.2017B020204003）； 福建省科技厅基本公益专项（2019R1013-5）； 福建省海洋经济发展补助资金（FJHJF-L-2020-4）；
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拟穴青蟹是我国主要的经济养殖蟹类之一,广东省作为我国最大的青蟹养殖省份,养殖规模和养殖产量连年位居全国前列。已有研究表明,拟穴青蟹与其他无脊椎动物一样,其血淋巴中存在微生物,且相对稳态的血淋巴微生物数量和菌群结构对维持青蟹正常的生理状态至关重要。本研究结果表明:1、检测不同环境因子（氨氮、病毒、p H、盐度、温度、光照）应激条件下拟穴青蟹血淋巴中ROS含量变化,表明环境因子会显著影响青蟹血淋巴中ROS含量,选择ROS增加（WSSV感染、p H 10.5）和ROS减少(高温35℃、高氨氮NH4Cl 80 mg·L-1)的4种条件下分析青蟹血淋巴微生物菌群结构变化。利用16S r DNA全长测序技术分析了拟穴青蟹血淋巴中主要微生物类群,包括变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）,放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）等;不同的环境因子应激会显著改变血淋巴微生物组成,血淋巴微生物多样性与ROS含量呈负相关。在青蟹血淋巴中有52种核心微生物菌群为组成型菌种,无论是否在应激条件下其组成均未发生改变;同时也发现与氨氮、温度、WSSV和p H等环境因子应激关联的优势菌种,分别为Bacillus pseudofirmus、Staphylococcus sp.、Trichococcus pasteurii和Alishewanella sp.;采用平板分离法获得3株与16S r DNA扩增子测序在种水平相同的青蟹血淋巴可培养微生物,分别为Exiguobacterium profundum、Acinetobacter johnsonii和Vibrio parahaemolyticus。2、克隆得到拟穴青蟹Spp38基因c DNA序列全长为2691 bp,包含保守的Thr-Gly-Tyr（TGY）双重磷酸结构基序和Ala-Thr-Arg-Trp（ATRW）底物结合位点,Spp38基因序列与中华绒螯蟹Esp38的相似性最高,与其他甲壳动物p38的氨基酸序列也存在较高的保守性;Spp38在各组织中分布均有表达,以肌肉和肝胰腺的表达量最高;在副溶血弧菌（Vp）和脂多糖（LPS）的刺激条件下,拟穴青蟹血细胞和肝胰腺中的Spp38转录本呈显著性上调,双荧光素酶报告基因显示Spp38可以激活青蟹抗脂多糖因子SpALF 1～SpALF 6的表达;通过RNAi敲降Spp38的表达后,青蟹抗脂多糖因子（SpALFs）和双氧化物酶基因（SpDuoxs）的表达量降低,血淋巴中活性氧（ROS）的含量降低,微生物数量显著增加;敲降Spp38的表达后采用副溶血弧菌（Vp）感染,拟穴青蟹血淋巴的细菌清除能力显著降低。3、重组表达纯化GST-Spp38蛋白并进行GST pull-down实验筛选获得亮氨酸拉链蛋白2、转录因子ENY2、丝裂原活化蛋白激酶14B、双重特异性丝裂原活化蛋白激酶激酶6、丝裂原活化蛋白激酶14C等与Spp38潜在的互作蛋白;RNAi敲降Spp38后的转录组测序分析,筛选到可能与Spp38蛋白互作的转录因子ATF-b、Myb/SANT-like和氧化酶相关基因NADPH等;Spp38干扰后的血淋巴微生物高通量测序分析结果发现,Spp38调控的主要微生物类群为腐螺旋菌科、海居菌属、弧菌属、嗜氢菌属和气单胞菌属等。4、克隆得到拟穴青蟹SpDuox1和SpDuox2启动子序列,长度分别为1884 bp和2823 bp,预测包括FOXO3a、FOXO1、STAT4、c-Jun、c-fos、c-Myb、c-Myc、p53、ATF3和ATF2等转录因子结合位点,采用DNA pull-down及LC-MS/MS质谱分析鉴定得到丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶BRSK1、转录因子AP-2、转录中介因子1等蛋白;克隆得到拟穴青蟹SpATF2 c DNA序列全长为2747 bp,编码711个Aa,在其N端具有典型的Cys2 His2形式锌指结构域,C端具有典型的b ZIP亮氨酸拉链样结构域,可结合形成二聚体;SpATF2在肌肉和肝胰腺中高表达;在Vp和白斑综合征病毒（WSSV）的感染应激下,拟穴青蟹血细胞和肝胰腺中的SpATF2转录本呈显著性上调;生物膜干涉（BLI）分析结果显示SpATF2蛋白与Spp38蛋白具有互作关系;双荧光素酶报告基因显示SpATF2可以激活拟穴青蟹双氧化物酶SpDuox1的表达;通过RNAi敲降SpATF2表达后,青蟹SpDuox1的表达量降低,活性氧（H2O2）的产生减少,血淋巴中微生物数量显著增加;敲降SpATF2的表达后采用副溶血弧菌（Vp）感染,拟穴青蟹血淋巴的细菌清除能力显著降低。本研究基于血淋巴微生物稳态在无脊椎动物中主要作用的认识,开展拟穴青蟹Spp38-SpATF2-SpDuox1信号级联参与血淋巴微生物稳态调控机制及其在抗细菌免疫过程中功能的研究,以期在理论上获得对青蟹血淋巴微生物稳态调控机制的新认识,丰富完善无脊椎动物免疫系统理论。
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