论文部分内容阅读
目的研究野菊花总黄酮（total flavonoids of Chrysanthemum，TFC）对佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠炎症和免疫反应的调节作用，探讨TFC对AA大鼠腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophages，PMΦ）产生的炎症细胞因子、ERK信号转导通路的影响，阐明TFC调节AA大鼠抗炎免疫活性及其信号转导机制。通过透射电子显微镜、免疫组织化学法、细胞凋亡等方法检测TFC对AA大鼠滑膜组织和滑膜细胞的凋亡影响，探讨诱导滑膜细胞凋亡的Caspase-3分子机制。方法以关节肿胀度、多发性关节炎指数、体重等改变评价佛氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant，FCA）诱导大鼠AA模型及TFC对AA大鼠的保护作用，免疫组化法观察血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在滑膜组织中血管壁的表达情况；测定ConA、LPS诱导AA大鼠脾淋巴细胞增殖反应及TFC对其影响；通过放射免疫法、免疫组化法、RT-PCR探讨PMΦ等分泌细胞因子的改变；体外以不同浓度TFC刺激大鼠PMΦ或以PKC抑制剂Chelerythrine预先孵育巨噬细胞，再用TFC刺激PMΦ，Western blot检测PMΦp-ERK1／2的表达改变。应用透射电子显微镜从膝关节滑膜超微结构的改变了解滑膜细胞形态学变化，探讨TFC对AA大鼠治疗作用；膝关节滑膜组织免疫组化法和图像分析技术观察TFC对NF-κB、Bcl-2、Bax的影响，探讨其诱导滑膜组织凋亡的内在联系；组织块培养法或胶原酶-胰蛋白酶消化法分离培养大鼠膝关节滑膜细胞，MTT法检测TFC对滑膜细胞增殖的影响；利用TUNEL染色、Hoechst33258荧光染色、琼脂糖凝胶电泳观察滑膜细胞DNA碎片改变以探讨TFC对滑膜细胞凋亡影响；Western blot分析Caspase-3活化片段蛋白的表达变化，AnnexinⅤ荧光染色检测Caspase-3特异性阻断剂对滑膜细胞凋亡的影响，通过上述方法，从细胞凋亡的角度探讨TFC治疗AA大鼠作用机理。结果TFC(84，168，336mg·kg-1，ig)可减轻AA大鼠继发性足肿胀，显著降低了AA大鼠多发性关节炎指数、缓解AA大鼠体重的下降。TFC可下调VEGF在血管壁的表达，减轻血管内皮细胞增殖和血管翳的新生。TFC(84，168，336mg·kg-1，ig)明显恢复AA大鼠低下的脾淋巴细胞增殖反应和脾淋巴细胞IL-2产生，抑制AA大鼠PMΦ，产生过高的IL-1β、PGE2、TNF-α水平，免疫细胞化学也提示TFC作用后TNF-α蛋白在AA大鼠PMΦ中表达下降，体外研究表明TFC(0.005，0.05，0.5，5，50 mg·L-1)可纠正FAA大鼠低下的脾淋巴细胞增殖反应，降低AA大鼠PMΦ产生过高的IL-1β、TNF-α；RT-PCR结果表明TFC使TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平下降。未受TFC刺激的AA大鼠PMΦp-ERK1／2处于低活性状态，体外给予TFC刺激PMΦ，其p-ERK1／2的蛋白表达水平显著高于对照组；但经PKC抑制剂Chelerythrine预先孵育PMΦ后，其p-ERK1／2的蛋白表达水平明显低于50 mg·L-1 TFC刺激组。电镜结果表明TFC可改善滑膜细胞的形态异常。MTT法显示TFC抑制滑膜细胞增殖，并且呈剂量依赖性趋势，TFC作用48h的IC50为115mg·L-1；免疫组化示TFC降低了滑膜组织NF-κB的活性，使Bcl-2／Bax比值降低，细胞凋亡率升高；DNA凝胶电泳呈现出阶梯状凋亡条带，Hoechst33258染色观察到细胞核出现凋亡小体，TUNEL染色观察到TFC增加了滑膜细胞凋亡率；Western blot示滑膜细胞Caspase-3活化片段蛋白表达明显升高，其升高幅度与TFC浓度有关；AnnexinⅤ荧光染色显示Caspase-3特异性阻断剂可以减轻AA大鼠滑膜细胞凋亡。结论TFC可改善AA大鼠关节炎症状，调节AA大鼠异常的免疫功能，平衡细胞因子产生，减少炎症介质的释放，调节机体免疫功能，通过PKC途径激活PMΦ的p-ERK1／2是其治疗AA大鼠作用机制之一。TFC可恢复AA大鼠滑膜细胞具分泌功能细胞器的形态，抑制AA大鼠增生的滑膜细胞，促进滑膜细胞的凋亡而达到治疗AA作用，其诱导滑膜细胞凋亡机制与活化Caspase-3功能有关。