骨保护素(osteoprotegerin, OPG)是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)受体超家族成员中的一种。它可与核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-KB, RANK)竞争结合核因子κB受体活化因子配体(ligand of receptor activator of nuclear factor-κB, RANKL)。OPG作为一种可溶性诱导受体,通过与RANKL竞争性结合,阻断RANKL与RANK的结合,抑制其生理效应的发挥。OPG、RANKL、RANK三者共同组成OPG/RANKL/RANK系统,是近年来骨科专业领域中的一个重大突破。研究发现许多激素、细胞因子等直接或间接地调控OPG、RANKL和RANK之间的比例,从而介导破骨细胞(osteoclast,OC)的分化、成熟而达到抗骨质疏松或致骨质疏松的作用。越来越多的的研究表明OPG/RANKL/RANK系统除了在骨代谢方面起到重要作用外,也参与了心血管系统疾病的发生发展过程,在血管钙化、动脉粥样硬化、心力衰竭等方面发挥重要作用,为心血管疾病的诊断、治疗及预后提供临床指导意义。目前确切的分子生物学机制暂不清楚,其作用途径可能包括对血管钙化、内皮细胞炎症因子的调节以及基因多态性的影响等。OPG/RANKL/RANK系统已成为心血管疾病研究的一个新热点。慢性心力衰竭是多种心脏疾病发展到终末阶段的一组综合临床表现。大量试验证实心肌细胞凋亡及心室重构是慢性心力衰竭发生发展的主要机制。Erkol等研究表明,血清OPG水平变化与经皮冠状动脉介入治疗后再次发生心肌梗死的面积密切相关,提示OPG水平可能影响到左心室重构。还有研究发现,急性冠状动脉综合征患者,当并发心功能不全时OPG水平升高更明显,其原因可能为心功能不全诱发血管细胞分泌OPG。血清OPG、RANKL浓度与心衰患者病情进展及严重程度密切相关,临床上可作为心衰患者治疗效果及预后评价的新预测因素。Omland等研究发现,在普通人群中血清OPG浓度的高低与心室质量、左心室壁厚度和左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)有显著的关系性；在对部分影响冠状动脉粥样硬化性心脏病的可能因素进行排除后,血清OPG的浓度仍然与心衰患者病情严重程度密切相关,OPG/RANKL/RANK系统可能参与心衰的病理过程。目前国内关于OPG/RANKL/RANK系统在心血管领域的研究主要集中在血管钙化、动脉粥样硬化及冠心病方面,对慢性心力衰竭的影响及作用机制研究的报道较少见。本研究旨在探讨不同浓度RANKL对LPS诱导新生大鼠心肌细胞纤维化信号机制的影响以及二甲双胍对OPG/RANKL/RANK系统的调节作用,从而在临床中为慢性心力衰竭的评估及治疗提供新的途径。第一章不同浓度RANKL对LPS诱导新生大鼠心肌细胞纤维化信号机制的影响目的：采用细菌内毒素脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导刺激新生大鼠心肌细胞上调表达相关纤维化细胞因子,进而研究不同浓度RANKL对体外大鼠心肌细胞白细胞介素(Interleukins, ILs)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)/基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs)等细胞因子及转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)/Smad信号通路的影响,部分阐明OPG/RANKL/RANK轴引起心肌纤维化的作用机制。方法：对体外大鼠心肌细胞进行培养、鉴定及质量评价。常规培养心肌细胞72h后,根据不同的给药方式分为6组：对照组、LPS组、LPS+RANKL50ng/ml组、LPS+RANKL100ng/ml组、LPS+RANKL200ng/ml组以及RANKL200ng/ml组。酶联免疫吸附法检测心肌细胞IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-a;免疫组化法检测MMP-2、MMP-9、TIMP-1;实时荧光定量PCR法检测心肌细胞TGF-β1、Smad2/3、 Smad7 mRNA表达；Western blot方法检测TGF-β1、Smad2/3、Smad7蛋白表达。结果：(1) IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-a水平：心肌细胞IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-a组间比较均有统计学差异(P<0.05)。与对照组比较,LPS组IL-1β、IL-6、IL-10、 TNF-a水平显著增加(P<0.05)。LPS联用不同浓度RANKL作用组大鼠心肌细胞IL-1β、IL-6、TNF-a水平较LPS组显著增加,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。随着RANKL浓度的增加,IL-1β、IL-6、TNF-a水平逐渐升高,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。LPS联用不同浓度RANKL作用组大鼠心肌细胞IL-10水平与LPS组比较,组间差异无统计学意义(P>0.05)。RANKL单独干预组IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-a水平与对照组比较,组间差异无统计学意义(P>0.05)。(2) MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平：心肌细胞MMP-2、MMP-9、TIMP-1组间比较均有统计学差异(P<0.05)。与对照组比较,LPS组MMP-2、MMP-9、 TIMP-1表达显著增加(P<0.05)。LPS联用不同浓度RANKL组大鼠心肌细胞MMP-2、MMP-9的表达较LPS组增加,TIMP-1表达下降,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。随着RANKL浓度的增加,MMP-2、MMP-9表达逐渐升高,TIMP-1表达下降,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。RANKL单独干预组MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平与对照组比较,组间差异无统计学意义(P>0.05)。(3) TGF-β1、Smad2/3、Smad7 mRNA表达：心肌细胞TGF-β1、Smad2/3、 Smad7 mRNA表达组间比较均有统计学差异(P<0.05)。与对照组比较,LPS组大鼠心肌细胞TGF-β1、Smad2/3、Smad7 mRNA表达显著增加(P<0.05)。LPS联用不同浓度RANKL组大鼠心肌细胞TGF-β1、Smad2/3 mRNA的表达较LPS组增加,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。随着RANKL浓度的增加,TGF-β1、Smad2/3 mRNA的表达逐渐升高,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。与LPS组比较,LPS+RANKL200ng/ml组大鼠心肌细胞Smad7 mRNA的表达显著下降(P<0.05)。RANKL单独干预组TGF-β1、Smad2/3、Smad7 mRNA表达与对照组比较,组间差异无统计学意义(P>0.05)。(4) TGF-β1、Smad2/3、Smad7蛋白表达：心肌细胞TGF-β1、Smad2/3、 Smad7蛋白表达组间比较均有统计学差异(P<0.05)。与对照组比较,LPS组TGF-β1、Smad2/3、Smad7蛋白表达显著增加(P<0.05)。LPS联用不同浓度RANKL组大鼠心肌细胞TGF-β1、Smad2/3蛋白表达较LPS组增加,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。随着RANKL浓度的增加,TGF-β1、Smad2/3蛋白表达逐渐升高,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。LPS联用不同浓度RANKL组Smad7蛋白表达与单用LPS组比较,组间差异无统计学意义(P>0.05)。RANKL单独干预组TGF-β1、Smad2/3、Smad7蛋白表达与对照组比较,组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论：(1) LPS (1mg/L)能够诱导大鼠心肌细胞上调纤维化相关因子的表达。(2) RANKL提高LPS诱导大鼠心肌细胞IL-1β、IL-6、TNF-a的表达,提示RANKL通过促进炎性细胞因子表达、激活炎症反应,加重心肌纤维化。(3) RANKL提高LPS诱导大鼠心肌细胞MMP-2、MMP-9的表达,抑制TIMP-1表达,提示RANKL通过调节MMPs/TIMPs,破坏细胞外基质合成降解平衡,加重心肌重构。(4) RANKL提高LPS诱导大鼠心肌细胞TGF-β1、Smad2/3的表达,提示RANKL通过增强TGF-β1/Smad信号传导通路活性,调控LPS诱导大鼠心肌细胞产生纤维化相关因子。第二章二甲双胍对慢性心力衰竭大鼠心肌OPG/RANKL/RANK表达及相关机制的研究目的：研究二甲双胍对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞OPG/RANKL/RANK表达的影响以及其相关机制的探讨。方法：清洁级健康雄性SD大鼠75只分成2组：假手术组和模型组。模型组大鼠采用腹主动脉缩窄法复制心脏压力负荷超载慢性心衰模型,造模8周。根据不同给药方式分为6组：假手术组、未治疗组、低剂量二甲双胍组、高剂量二甲双胍组、二甲双胍加抑制剂组以及单用抑制剂组。给药8周后,测定各组大鼠血糖、血乳酸、血浆及左心室心肌组织一氧化氮(nitric oxide,NO)含量；行心脏彩超及血流动力学检测；Masson染色观察胶原纤维改变；实时荧光定量PCR法检测心肌组织OPG、RANKL、RANK mRNA的表达；Western blot方法检测心肌组织腺苷活化蛋白激酶α(adenosine monophosphate activated protein kinase α, AMPKα)、磷酸化腺苷活化蛋白激酶α(P-adenosine monophosphate activated protein kinase α, P-AMPKα)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)、磷酸化内皮型一氧化氮合酶(p-endothelial nitric oxide synthase, p-eNOS)、OPG、RANKL、RANK蛋白的表达。结果：(1)体重、心率、血糖、血乳酸指标：大鼠体重、血糖、血乳酸组间比较无统计学差异(P>0.05)。大鼠心率组间比较有统计学差异(P<0.05)。与假手术组比较,各模型组心率均显著加快(P<0.05)。(2)超声心动图指标：左心室舒张末内径(left ventricular end-diastole dimension, LVEDD)、左心室收缩末内径(left ventricular end-systolic dimension, LVESD)、LVEF、左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)组间比较均有统计学差异(P<0.05)。与假手术组比较,各模型组LVEDD、 LVESD显著增大(P<0.05),LVEF、LVFS显著降低(P<0.05)。与未治疗组相比,予不同浓度二甲双胍给药后,大鼠LVEDD、LVESD显著降低(P<0.05),LVEF、LVFS显著升高(P<0.05)。与高剂量二甲双胍组比较,二甲双胍加抑制剂组LVEDD、LVESD显著升高(P<0.05),LVEF、LVFS显著下降(P<0.05)。单用P-AMPK抑制剂组与未治疗组LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS值比较,组间差异无统计学意义(P>0.05)。(3)血流动力学指标：左室舒张末期压(left ventricular end-diastole pressure, LVEDP)、左心室收缩时室内压最大上升速率(+dP/dt)及左心室舒张时室内压最大下降速率(-dP/dt)组间比较均有统计学差异(P<0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠LVEDP显著升高(P<0.05),+dp/dt及-dp/dt显著降低(P<0.05)。与未治疗组相比,予不同浓度二甲双胍给药后,大鼠LVEDP显著下降(P<0.05),+dp/dt及-dp/dt显著升高(P<0.05)。与高剂量二甲双胍组比较,二甲双胍加抑制剂组LVEDP显著上升(P<0.05),+dp/dt及-dp/dt显著下降(P<0.05)。单独使用抑制剂组与未治疗组LVEDP、+dp/dt及-dp/dt值比较,组间差异无统计学意义(P>0.05)。(4)心肌组织胶原纤维的改变：与假手术组相比,各模型组心肌纤维化程度加重。给予不同浓度二甲双胍治疗后,心肌纤维化程度均减轻,其中高剂量组减轻程度最明显。大鼠心肌CVF值组间比较有统计学差异(P<0.05)。与假手术组比较,各模型组大鼠心肌CVF显著升高(P<0.05)。与未治疗组相比,予不同浓度二甲双胍给药后,CVF显著降低(P<0.05)。二甲双胍加抑制剂组CVF值较高剂量二甲双胍组显著升高(P<0.05)。单独使用抑制剂组与未治疗组CVF值比较,组间差异无统计学意义(P>0.05)。(5)心肌组织AMPKα、p-AMPKα、eNOS、p-eNOS蛋白表达：AMPKα、 eNOS蛋白表达组间比较无统计学差异(P>0.05)。p-AMPKα、p-eNOS蛋白表达组间比较有统计学差异(P<0.05)。进行多重比较,未治疗组p-AMPKα及p-eNOS蛋白表达与假手术组比较,组间差异无统计学意义(P>0.05)。给予不同浓度二甲双胍处理8周,大鼠心肌p-AMPKα及p-eNOS蛋白表达较假手术组显著升高(P<0.05)。随浓度增加,大鼠心肌p-AMPKα及p-eNOS蛋白表达逐渐升高,组间差异有统计学意义(P<0.05)。加入p-AMPK抑制剂Compound C阻断二甲双胍对AMPK的磷酸化作用后,p-AMPKa及p-eNOS蛋白表达显著下降(P<0.05)。与未治疗组比较,单独使用抑制剂组心肌p-AMPKa及p-eNOS蛋白表达显著下降(P<0.05)。(6)血清及心肌组织NO水平：大鼠血清及心肌组织NO水平组间比较有统计学差异(P<0.05)。进行多重比较,未治疗组大鼠血浆及心肌NO水平与假手术组比较,组间差异无统计学意义(P>0.05)。给予不同浓度二甲双胍处理8周,大鼠血浆及心肌NO水平较未治疗组显著增高(P<0.05)。随二甲双胍浓度增加,大鼠血浆及心肌NO水平逐渐升高,组间差异有统计学意义(P<0.05)。二甲双胍加入P-AMPK抑制剂Compound C后,血浆及心肌NO水平较高剂量二甲双胍组显著下降(P<0.05)。与未治疗组比较,单独使用抑制剂组血浆及心肌NO水平显著下降(P<0.05)。(7)心肌组织OPG、RANKL、RANK mRNA表达：大鼠心肌组织OPG、 RANKL、RANK mRNA表达组间比较均有统计学差异(P<0.05)。与假手术组比较,各模型组大鼠心肌组织OPG、RANKL、RANK mRNA表达显著增加(P<0.05)。给予低剂量二甲双胍处理8周,大鼠心肌OPG、RANK mRNA表达与未治疗组比较,组间差异无统计学意义(P>0.05),但RANKL mRNA表达显著下调(P<0.05)。给予高剂量二甲双胍处理8周,大鼠OPG mRNA表达较未治疗组显著增高(P<0.05),RANKL、RANK mRN A表达显著下调(P<0.05)。二甲双胍加入Compound C后,OPG表达较高剂量二甲双胍组显著下降(P< 0.05), RANKL、RANK mRNA表达显著上调(P<0.05)。与未治疗组比较,单独使用抑制剂干预组OPG mRNA表达显著下降(P<0.05),RANKL、RANK mRNA表达显著上调(P<0.05)(8)心肌组织OPG、RANKL、RANK蛋白表达：大鼠心肌组织OPG、RANKL、 RANK蛋白表达组间比较有统计学差异(P<0.05)。与假手术组比较,各模型组大鼠心肌组织OPG、RANKL、RANK蛋白表达显著增加(P<0.05)。给予低剂量二甲双胍处理8周,大鼠心肌OPG、RANK表达与未治疗组比较,组间差异无统计学意义(P>0.05),但RANKL蛋白表达显著下调(P<0.05)。给予高剂量二甲双胍处理8周,大鼠OPG蛋白表达较未治疗组显著增高(P<0.05),RANKL、 RANK蛋白表达显著下调(P<0.05)。二甲双胍加入AMPI抑制剂Compound C后,OPG蛋白表达较高剂量组显著下降(P<0.05),RANKL、RANK蛋白表达显著上调(P<0.05)。与未治疗组比较,单独使用抑制剂组OPG蛋白表达显著下降(P<0.05),RANKL、RANK蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论：(1)二甲双胍有改善心脏功能、减轻心肌纤维化、延缓心室重构作用。(2)二甲双胍可能通过上调慢性心衰大鼠心肌细胞OPG表达、下调RANKL和RANK表达来改善心肌纤维化,其作用呈浓度依赖性。(3)二甲双胍可能通过激活AMPK-eNOS-NO通路,对OPG/RANKL/RANK起到调控作用。