论文部分内容阅读
研究背景肺癌是最常见的恶性肿瘤。鳞状细胞肺癌(squamous cell lung carcinoma,SqCLC),作为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的一个组织学亚型,约占病例总数的25-30%。基于SqCLC的EGFR、ALK、ROS-1阳性率低,因此SqCLC的主要辅助治疗方法依赖于放化疗。吉西他滨(Gemcitabine)联合顺铂(cisplatin,CDDP)方案是SqCLC的一线化疗方案,在疗效、疾病进展时间和总生存率方面均优于单用CDDP方案。患者在化疗期间往往会出现不同程度的副作用。这可能影响生活质量,甚至因无法耐受化疗而终止。同时,在化疗中也存在耐药性。因此,目前越来越多的研究致力于SqCLC新的诊疗方法。溶瘤病毒(oncolytic viruses,OVs)是一种治疗癌症的新方法。一方面,OVs疗法通过应用天然或基因工程改造的病毒在癌细胞内选择性复制,表达目标基因杀死癌细胞;另一方面,可通过免疫介导的癌细胞清除途径或肿瘤血管的靶向性间接地杀死癌细胞。本课题组前期将腺病毒通过基因工程改造并重组成为OVs,命名为Ad-Apoptin-hTERTp-E1a(Ad-VT)。Ad-VT对肿瘤细胞选择性识别并感染,大量增殖,同时表达凋亡素蛋白(Apoptin),最终导致肿瘤细胞死亡。前期研究结果展现出Ad-VT对不同肿瘤均有显著的溶瘤效应。同时,临床前安全性评估表明,Ad-VT对呼吸、消化、神经或心血管系统没有明显不良影响。研究目的本研究拟联合应用重组腺病毒Ad-VT与Gemcitabine治疗肺鳞癌细胞NCI-H226。寻找最佳浓度组合进行体内、体外研究,并期望达到减少Gemcitabine副作用和提高SqCLC疗效的效果。研究方法采用结晶紫染色和WST-1法检测重组腺病毒、Gemcitabine及联合组对NCI-H226和BEAS-2B细胞的增殖抑制作用。CalcuSyn软件根据不同治疗组合的抑制率计算联合指数(combination index,CI),筛选最佳组合,并进行细胞周期检测。用Hoechst、Annexin V、JC-1染色探究Ad-VT与Gemcitabine联合应用诱导NCI-H226细胞凋亡的影响。细胞划痕法、Transwell和BioCoat实验检测并比较治疗后NCI-H226细胞的迁移和侵袭能力。体内实验中,在NCI-H226细胞体内异种移植瘤形成后,采用测量肿瘤体积、小鼠体重,肝脏和肾脏H&E染色和生存分析等方法检测并比较不同治疗的抑瘤作用及毒性作用。研究结果Ad-VP3、Ad-T、Ad-VT在感染NCI-H226后,结晶紫的染色强度呈下降趋势,具有剂量-时间依赖效应,染色强度Ad-VT<Ad-T<Ad-VP3。同样一种重组腺病毒,同样剂量下,染色强度72h<48h<24h。Ad-Mock组无明显变化。WST-1检测结果与结晶紫染色结果一致。剂量为100MOI时Ad-VP3、Ad-T、Ad-VT对NCI-H226抑制率在72h到达峰值。联合实验中发现,Ad-VT联合Gemcitabine组随着剂量增加,结晶紫染色强度降低更明显,说明对NCI-H226的增殖抑制作用最强,尤其在72h。WST-1结果显示,72h联合组5nM+5MOI和10nM+10MOI的抑制率与相应Gemcitabine和Ad-VT单药组存在显著性差异。在48、72h,随着剂量的增加,联合组/Ad-VT组和联合组/Gemcitabine组抑制率的比值呈明显下降趋势,联合组在低剂量时的抑制率明显高于单药组。对正常支气管上皮细胞BEAS-2B,结晶紫染色发现Ad-VT组之间没有明显变化。Gemcitabine组的染色强度随时间与剂量增加下降明显。联合组的染色强度类似于Gemcitabine组。WST-1结果显示,72h Gemcitabine组与Ad-VT组在10、15、20、30浓度下存在差异,联合组与Gemcitabine组比较差异无统计学意义。CalcuSyn软件计算得出,治疗72h,5nM+5MOI、10nM+10MOI和15nM+15MOI组的CI小于1,说明具有协同抑制作用。细胞周期检测结果显示,在G1期,Ad-VT组和联合组较对照组有明显下降趋势,而Gemcitabine组与对照组无显著差异。Ad-VT组及联合组G1细胞百分率均显著低于Gemcitabine组,Ad-VT组与联合组无显著性差异。在S期,联合组S期细胞百分率明显高于对照组。Hoechst结果显示,经Ad-VT 10MOI、Gemcitabine 10nM和联合组处理的NCI-H226细胞,细胞核呈现不同程度的亮蓝色浓染或碎裂,细胞数呈下降趋势。Annexin V-FITC/PI检测发现,Gemcitabine 10nM组、Ad-VT 10MOI组和联合10nM+10MOI组的凋亡率高于对照组。组间比较,联合组>Ad-VT组>Gemcitabine组。JC-1检测结果表明,与对照组相比,Ad-VT、Gemcitabine及联合组凋亡细胞逐渐增多,MMP去极化。酶标仪检测显示,Gemcitabine组、Ad-VT组和联合组的红/绿荧光比值明显低于对照组和Ad-Mock组。联合组的红/绿荧光比值明显低于单药组。划痕实验结果显示,Ad-VT、Gemcitabine及联合组细胞迁移率明显低于对照组。联合组细胞迁移率明显低于Gemcitabine组,但与Ad-VT组无显著性差异。Transwell检测结果显示,Ad-VT 10MOI、Gemcitabine 10nM及10MOI+10nM联合组迁移细胞数明显低于对照组。治疗组间比较,发现联合组的迁移细胞数明显低于单药组。BioCoat实验结果表明,Ad-VT 10MOI、Gemcitabine 10nM及联合组10MOI+10nM穿过基底膜的侵袭细胞数均明显低于对照组。治疗组间比较,发现联合组的侵袭细胞数明显低于单药组。体内研究中,Gemcitabine 30、60、120mg/Kg和Ad-VT(1×10~9 PFU)治疗组的肿瘤体积与对照组比较差异有统计学意义。随着Gemcitabine剂量的增加,小鼠肿瘤抑制率升高,但存活率逐渐降低。饲养过程中观察发现,高剂量Gemcitabine组小鼠进食差,体重下降快,死亡快。Ad-VT联合低剂量Gemcitabine对小鼠移植瘤的抑瘤率与生存率均明显高于高剂量Gemcitabine单药组。同时,低剂量Gemcitabine组和联合组小鼠体重无明显波动。H&E染色显示,低剂量Gemcitabine与Ad-VT联合治疗组肝脏和肾脏细胞无明显组织学改变。研究结论⒈Ad-VT联合吉西他滨具有协同效应,增加对肺鳞状细胞癌的增殖抑制率,降低吉西他滨的副作用⒉Ad-VT联合吉西他滨通过线粒体膜电位去极化诱导凋亡⒊Ad-VT联合吉西他滨抑制肺鳞状细胞癌迁移与侵袭能力