红平红球菌Rhodococcus erythropolis XP菌株的分子改造

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微生物法去除石油中的有机硫和有机氮作为传统的加氢处理方法的补充,具有广阔的研究空间和应用前景。目前,它所面临的挑战之一是获得具有实际应用潜力的生物催化剂。这要求该生物催化剂具有稳定且较高的活力,广泛的底物作用谱以应对石油中复杂的成分,同时有廉价的制备方法和高效的再生能力。本论文以一株红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)作为研究的出发菌株,该菌能够高效且专一性地脱除二苯并噻吩(dibenzothiophene)等有机含硫化合物中的硫元素,生成亚硫酸盐或硫酸盐,从而能降低化石燃料在燃烧过程中释放出的二氧化硫的含量,减少酸雨的形成。本论文克隆及表达了来自Pseudomonas sp.4-9的咔唑降解体系中的第一个基因--1,9a-双加氧酶基因(carA),该酶由三个组份构成,分别为末端加氧酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶,与模式菌株假单胞菌CA10的同源性分别为99%、100%和100%。1993年的报道指出该双加氧酶能够对咔唑分子进行双加氧反应生成2-氨基联苯-2,3二醇,但是该结果从未经过高分辨质谱方法的验证。本论文尝试了使用不同的表达载体来高效表达咔唑1,9a-双加氧酶基因,以此作用于底物咔唑来大量积累产物,以便于日后的产物鉴定及分析。石油中的含氮芳香化合物(如:咔唑)能够毒害加氢脱硫过程的催化剂,因此在进行加氢脱硫之前除去其中的含氮芳香化合物是很必要的。现在生物脱硫脱氮的研究是采用不同的菌株来进行的。在实际应用中如果能采用一个菌株同时降解掉原油中的硫、氮污染物必将大大降低处理的成本。本论文利用同源重组的原理,在pK18mobsacB载体的基础上,构建了一个能够把目的基因插入到红球菌XP的基因组的载体(pK18mobsacB-rrp-carA-rdna),该方法不在XP菌上留下任何选择标记,而且是固定地插入到其中的一个16S rRNA基因的拷贝上。利用该载体,本论文成功地把咔唑双加氧酶基因carA整合入了红球菌XP中。构建的工程菌株具有同时作用二苯并噻吩和咔唑的能力,通过此方法插入的外源基因比传统的以质粒形式存在的情况下更稳定。生物脱硫和脱氮的第一步反应均是加氧反应,其氧原子均来源于分子氧,提高氧气的浓度或在生物催化剂中的传输速度将有助于整个生物脱硫和脱氮反应。透明颤菌(Vitreoscilla sp.)在低氧环境下能通过表达一种类似人体血红蛋白的细菌血红蛋白,以提高氧气在其体内的传送速度。本论文克隆了编码该细菌血红蛋白的基因vhb,尝试了利用大肠杆菌-红球菌穿梭载体来把vhb基因导入XP菌株当中,并使其在XP中进行表达以提高该菌株的脱硫速率。此实验的最终目的是利用上述构建的载体把vhb基因整合至红球菌XP的基因组中,使其稳定地表达。
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