论文部分内容阅读
分选酶A（SrtA）具有膜结合巯基转肽酶催化的功能，是能将一些在细胞质中合成的革兰氏阳性菌表面致病蛋白锚定到菌体细胞壁上的关键酶。近年来，建立高通量有效分选酶A检测体系的方法，筛选分选酶A的抑制剂，寻求安全有效解决病原菌耐药性问题已成为国内外生化领域的研究热点。目的：引入分选酶A底物QALPETGEE序列至大肠杆菌-毕赤酵母穿梭表达质粒pKFS中，并以绿色荧光蛋白基因（EGFP）作为选择标记，构建酵母表面展示载体pKFS-QALPETGEE-EGFP，检测分选酶A活性。方法：（1）根据GenBank报道的绿色荧光蛋白EGFP基因序列，设计引物P1和P2，以pcDNA-myc-his-EGFP为模板，扩增出分选酶A底物QALPETGEEEGFP片段；（2）将QALPETGEE-EGFP片段进行TA克隆、酶切鉴定及测序之后，亚克隆至大肠杆菌-毕赤酵母穿梭表达载体pKFS中，重组子命名为pKFS-QALPETGEE-EGFP；（3）再将pKFS-QALPETGEE-EGFP转化至毕赤酵母GS115中，通过甲醇诱导表达以考察pKFS-QALPETGEE-EGFP在GS115中的表达稳定性；（4）将原核表达载体pTRX-srtA转入大肠感受态BL21（DE3）中，并从温度、诱导时间上进行优化，提高分选酶A的表达产量；（5）在合适的缓冲体系下，将在酵母表面展示的分选酶底物体系，与分选酶A进行相互作用，考察以酵母表面展示技术为基础的分选酶检测体系的有效性。结果（1）构建了克隆载体pMD19-QALPETGEE-EGFP；（2）构建了表达载体pKFS-QALPETGEE-EGFP，pKFS-QALPETGEE-EGFP化转至毕赤酵母GS115，获得重组菌GS115/pKFS-QALPETGEE-EGFP，在甲醇诱导下连续培养了7d，在荧光显微镜下观察，EGFP发出绿色荧光及强度随时间不断增强，生长情况良好，遗传性能稳定，这表明pKFS-QALPETGEE-EGFP可作为一个稳定的系统用于分选酶活性的检测。（3）优化分选酶诱导条件得到最佳条件为28℃诱导表达8h或者30℃诱导表达8h，在该条件下诱导表达的分选酶A与酵母表面展示的分选酶底物进行相互作用，经过荧光分光光度计和流式细胞仪检测，皆表明酵母表面展示体系GS115/pKFS-QALPETGEE-EGFP可用于分选酶A活性的高通量检测。