聚羟基脂肪酸酯(PHAs)是多种微生物在碳源过量或其他营养物质匮乏时,合成的碳源和能源的储藏化合物。PHAs的合成原料为可再生资源,具有良好的热塑性和弹性,易被生物降解,且无毒害作用,在工业和医药行业具有重要应用价值。聚羟基丁酸酯(PHB)是发现最早,研究最透彻的短链PHASCL,在细胞中以不溶性纳米粒/微粒形式存在。PHB颗粒含有一个聚酯核心,被单层磷脂膜包裹,膜上结合着多种蛋白,其中PhaP是主要结构蛋白。近年来,PHB的应用范围被逐渐扩大到生物医学领域,对真核药物蛋白的表面表达和纯化具有重要作用。　　 本研究从Ralstonia eutropha H16中克隆了PHB生物合成途径中的三个催化酶:β-酮硫解酶(PhbA)、乙酰乙酰-CoA还原酶(PhbB)和PHA合酶(PhbC),将这三个酶的编码基因置于rpoS基因的启动子下游,构建了由生长压力诱导从而启动转录的PHB操纵子。将载有该操纵子的质粒pHBS01分别导入Eschericha.coli XL1-Blue和BL21(DE3)中,在LB培养基中以0.5％葡萄糖为碳源进行发酵,检测两种重组菌株的生长状态和合成PHB的能力。结果表明,E.coli XL1-Blue/pHBS01的生物量约为BL21(DE3)的两倍;其胞内PHB颗粒的含量占菌体干重的25％,约是BL21(DE3)/pHBS01中PHB含量的三倍(9％),且XL1-Blue/pHBS01合成的PHB颗粒数量较多,形态较小,均匀布满于整个细胞。　　 已知PHB颗粒表面共价结合大量小分子蛋白PhaP,通过融合表达策略可以将外源蛋白锚定到颗粒表面。载有融合蛋白的PHB颗粒经过简单的超速离心即可分离纯化,较传统的蛋白纯化方法简便经济、可靠易行。因此,上述构建的重组E.coli XL1-Blue/pHBS01是一种基于PHB颗粒的蛋白表面表达系统。　　 在正常生理条件下,E.coli胞内的还原态不利于二硫键的形成,含有较多二硫键的真核蛋白往往以无活性的包涵体形式存在于E.coli胞质中。为解决此问题,我们选择了重组人组织纤溶酶原激活剂(rPA)作为研究蛋白。rPA分子内含有九对二硫键,是一种很难在E.coli胞质中进行活性表达的非糖基化真核药物蛋白。我们将rPA基因克隆到小分子蛋白PhaP基因的C端,在基因之间引入凝血酶切割位点,构建了受Plac启动子调节的PhaP-rPA融合蛋白表达载体pSPAr,并将此质粒转化到压力诱导合成PHB的XL1-Blue/pHBS01细胞中,构建了重组菌XL1-Blue(pHBS01+pSPAr)。在LB培养基中以0.5％葡萄糖为碳源,在指数生长后期诱导PhaP-rPA融合蛋白的表达。SDS-PAGE和免疫印记检测结果表明,PhaP-rPA融合蛋白成功展示在PHB颗粒表面,且具有溶纤维蛋白活性,酶活约为760IU/g细胞干重,产量为53.8μg/g细胞。上述结果表明,PHB合成过程中对还原力NADPH的消耗改变了E.coli胞内的还原态,有效地促进了分子内含有复杂二硫键真核蛋白的活性表达;此外,PHB颗粒稳定性高、纯化过程简便经济,因此,本研究构建的PHB表面表达系统,为分子内含有二硫键外源蛋白的活性表达和纯化,提供了有价值的理论参考和技术基础。　　 把rPA活性展示在PHB颗粒表面用的是双质粒系统,不仅需要考虑质粒的相容性,而且双重抗生素会加大宿主的代谢负担,从而降低该系统的稳定性并限制其扩大应用。为此,我们将编码PHB合成的三个酶的基因置于经过改造的单拷贝tac启动子下游,构建了组成型表达的PHB操纵子,并利用高效的大片段重组技术将其整合到E.coli的poxB基因位点。实验结果表明,该菌株在以葡萄糖为碳源的M9培养基中,不添加任何诱导剂即可稳定合成PHB,但产量较低。于是我们采用启动子改造工程,首次将PHB合成基因置于5个串联重复的Pmtac启动子下游,使改造后的菌株合成PHB的能力提高了5倍,为对该菌株的进一步遗传操作以提高PHB的产量提供了理论指导,从而为构建稳定的PHB颗粒表面表达系统奠定了理论和技术基础。