邻苯二甲酸（2-乙基己基）酯[di-(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP]是典型的一类邻苯二甲酸酯，是应用广泛的一种塑化剂，它极易从塑料产品上释放出来污染生态环境，从而使人类和野生动物暴露其中。大量实验表明，DEHP是一类环境内分泌干扰物，使机体产生生殖发育毒性、遗传毒性和多种器官癌变等损伤，但是目前人们对其神经发育毒性的认识还很少。性激素对神经元树突发育和突触发生起重要作用，并因此影响脑的发育和功能。由于DEHP具有抗雄激素和拟雌激素的活性，进入机体后可能会干扰性激素的正常生理活性，影响个体的神经系统发育。本实验室前期的研究表明，围生期暴露DEHP会使小鼠产生学习记忆损伤和焦虑抑郁样的行为，表明DEHP影响动物的神经行为发育。鉴于神经元的形态结构是其活动的基础，我们推测DEHP可能会影响神经元的发育。　　在神经元发育的初期，树突干上生长许多树突生长锥和树突丝，之后，树突丝逐渐被粗而短，形态相对稳定的树突棘所取代，而90％以上的兴奋性突触发生于树突棘。成熟稳定的树突棘是神经元间产生突触联系的重要结构基础。突触密度大表示神经系统的突触网络连接非常复杂，且可塑性潜力较大。因此，神经元的树突棘发育、突触的建立和神经回路的形成就构成了脑发育的关键环节。雌激素可与雌激素受体结合，通过激活一系列信号通路或调节基因的表达，参与调节树突发育和突触可塑性。突触部位关键蛋白的水平变化直接影响突触间的传递效能。突触素Ⅰ(SynapsinⅠ)是位于突触前膜的一种标志性蛋白，细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)途径被激活后，可以使SynapsinⅠ发生磷酸化，参与调控突触前神经递质的释放。PSD95是神经元突触后致密区的脚手架蛋白，联系和锚定N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)、α-氨基-3羟基-5甲基-4异恶唑受体（AMPAR）和下游信号分子于突触后膜上，这种结构上的紧密联系在突触可塑性中发挥着重要作用。DEHP是否会通过与雌激素类似的途径影响树突和突触的发育，我们不得而知。　　本实验研究DEHP长时暴露对离体培养的海马神经元树突和突触发育的影响，利用雌激素受体阻断剂ICI182，780和Western blot技术初步探讨DEHP长时暴露的分子机制。　　方法:取新生24 h的健康SD大鼠乳鼠的海马，体外培养第5天(DIV5)进行DEHP暴露5天。首先，设置对照组(DMSO)、DEHP组（1、10、100nM，1和10μM），探究DEHP的剂量效应。于DIV10对细胞进行免疫荧光染色，观察神经元树突和突触的形态。其次，选取效应极显著的剂量（1nM或1μM）进一步研究，设置对照组、DEHP组、雌二醇(E2)组、DEHP+E2组，探讨DEHP与E2之间的关系;然后，应用雌激素受体阻断剂ICI182，780探究DEHP是否通过雌激素受体影响神经元的形态发育。　　采用罗丹明标记的鬼笔环肽特异性标记神经元纤维型肌动蛋白(F-actin)，在激光共聚焦显微镜下检测树突丝和树突棘的密度;采用免疫双荧光染色分别标记突触前蛋白SynapsinⅠ和细胞骨架F-actin，由SynapsinⅠ（绿色荧光）和F-actin（红色荧光）共定位突触（黄色荧光），统计树突上突触的密度。　　为了进一步探讨DEHP影响神经元形态发育的分子机制，采用western blot方法检测神经元SynapsinⅠ、PSD95和NMDAR亚基NR2B的蛋白水平，分析突触蛋白和兴奋性氨基酸受体亚基的变化;检测ERK和p-ERK的蛋白表达变化，以探究NMDAR和ERK信号途径是否参与DEHP长时暴露对神经元发育的影响。　　结果:1.DEHP(1 nM～10μM)暴露5天，显著降低海马神经元的树突丝和树突棘密度(P＜0.05，P＜0.01)，效应曲线呈“U”型，提示DEHP抑制神经元树突的发育;与E2组相比，（1nM或1μM）DEHP+E2组显著抑制树突丝和树突棘密度(P＜0.01)，提示DEHP与雌激素共同作用表现出拮抗的效应;DEHP+ICI组和DEHP组相比较，树突丝和树突棘的密度显著上调(P＜0.01)，但是DEHP+ICI组与ICI组存在显著差异(P＜0.01)，暗示雌激素受体阻断剂部分消除DEHP的抑制作用，推测雌激素受体参与DEHP对神经元树突发育的抑制效应。　　2.(1 nM～10μM)DEHP暴露5天显著降低海马神经元突触密度(P＜0.01)，10 nM DEHP对突触密度的影响无显著差异，效应曲线呈“U”型，提示DEHP抑制神经元突触的发育;（1nM或1μM）DEHP显著抑制E2对树突丝和树突棘密度的促进作用(P＜0.01)，提示DEHP与雌激素共同作用时表现出拮抗效应;DEHP+ICI组和DEHP组相比，突触的密度显著上调(P＜0.01)，而DEHP+ICI组与ICI组仍差异显著(P＜0.01)，提示雌激素受体阻断剂可以部分解除DEHP的抑制效应，推测雌激素受体可能参与其对突触发育的不利作用。　　3.Western blot分析结果发现，DEHP（1nM和1μM）长时暴露5天显著下调NMDAR亚基NR2B（P＜0.05或P＜0.01）及突触蛋白SynapsinⅠ(P＜0.01或P＜0.01)和PSD95（P＜0.01或P＜0.01）的表达水平，显著降低p-ERK的活性（P＜0.01或P＜0.01）。　　结论:DEHP长时暴露显著下调体外培养的大鼠海马神经元树突丝、树突棘和突触密度;同时降低突触蛋白SynapsinⅠ和PSD95的表达水平，使NMDAR亚基NR2B表达下调，p-ERK的活性降低，提示DEHP长时暴露抑制海马神经元的树突和突触发育;这种抑制效应可能通过雌激素受体介导的ERK途径调节突触部位的蛋白表达，影响神经元树突和突触的形态发育。另外，DEHP与雌激素共同作用时表现出拮抗效应。DEHP暴露抑制海马神经元树突发育和突触发生，可能是DEHP引起儿童出现多种神经行为缺陷的原因之一。