大豆真核翻译起始因子eIFE4基因的功能验证及转基因后代的抗病性选择

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wcfsoa2009
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大豆[Glycine max(L.)Merr.]起源于中国,在我国已有五千多年的栽培历史,是全球重要的油料作物和粮食作物之一。大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)属于马铃薯Y病毒属,SMV广泛分布于世界各大豆产区,会造成大豆减产以及品质恶化,是危害大豆的主要病毒之一。防治SMV最有效的方法是培育和推广抗病品种,由于SMV株系组成比较复杂,常规育种方法培育的大豆品种针对SMV的一个或两个特定株系,并不是广谱抗性,且地区流行株系组成也会发生变化,所以传统的育种方法很难培育出具有对当地多个流行株系具有广谱抗性的品种。而转基因技术的目标基因多数针对一类病毒而非个别株系,因此可以培育出对SMV具有广谱抗性的大豆品种。真核翻译起始因子eIF4E(eukaryotic translation initiation factor 4E)是广泛存在于真核生物体内的隐性抗病基因,也是多种RNA病毒侵染植物的必需因子之一。本文是在章红运报道的大豆eIF4E与大豆花叶病毒VPg蛋白互作的研究基础上,利用qRT-PCR、亚细胞定位以及蛋白互作实验对eIF4E基因的表达、细胞内作用位置以及与SMV其它成熟蛋白之间的互作分析,验证eIF4E基因是否参与SMV侵染大豆的过程。表达分析包括大豆内源基因eIF4E的诱导表达、组织表达和亚细胞定位。eIF4E在SC3诱导表达下,感病品种天隆一号在接种SC3后0~4h eIF4E基因的相对表达量出现明显上升趋势,在4h时达到最大,8h~12h明显下降,12h以后相对表达量差异不明显,而抗病品种科丰一号在接种SC3 0h~4h时间段eIF4E基因的相对表达量无明显变化,在8h后相对表达量明显下降,12h~72h相对表达量缓慢上升。说明感病植株在病毒进入4h时eIF4E表达量最高以协助SMV完成侵染,而抗病品种在SC3侵染时eIF4E表达量没有显著提高,没有与SMV的互作,SMV不能成功侵染,品种表现抗性。eIF4E基因在抗病品种科丰一号中的组织表达研究结果显示,其相对表达量大小顺序是根、花、荚、成熟种子、叶、茎。在感病品种天隆一号中eIF4E基因相对表达量大小顺序是根、荚、花、成熟种子、叶、茎。感病品种的根中eIF4E表达量是抗病品种的2倍多。亚细胞定位结果显示,绿色荧光出现在细胞膜与细胞核上,说明eIF4E在细胞的细胞膜和细胞核上大量表达。蛋白互作实验包括酵母双杂交和双分子荧光互补。酵母双杂交和双分子荧光互补实验结果显示,eIF4E蛋白与SMV的NIb、VPg、NIa-Pro蛋白互作。利用农杆菌介导eIF4Ei转基因大豆的T3和T4代抗病性研究结果显示:阳性T3、T4代转基因大豆所有家系对SMV流行株系SC3、SC7、SC15和SC18表现为高抗(HR)和延迟抗病(DR)。在接种大豆花叶病毒SMV15d和30d后进行qRT-PCR实验结果表明,SMV病毒含量在T3代、T4代阳性转基因植株体内含量低,而在非转基因植株体内含量高。接种SMV3周、5周后DAS-ELISA实验结果表明,转基因T3、T4植株多数表现为SMV阴性。种皮褐斑率调查显示,非转基因对照植株平均种皮褐斑率分别为51.82%和38.37%,而T3代、T4代转基因植株没有出现种皮褐斑。
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