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第一部分缺氧微环境对骨肉瘤细胞放疗抵抗能力的影响目的:研究缺氧微环境对骨肉瘤细胞放疗抵抗能力的影响。方法:分别培养人骨肉瘤MG-63细胞和经过低氧条件预处理的人骨肉瘤MG-63细胞,用梯度剂量X-ray进行照射处理。采用光镜下观察细胞形态,流式细胞技术(FCM)检测各组细胞凋亡,MTT比色法测定细胞增殖率,对比各组细胞增殖及凋亡水平。结果:在常氧条件下,6Gy的辐射剂量可显著抑制MG-63细胞的增殖,给予MG-63细胞缺氧预处理后,辐射损伤对于细胞增殖的抑制作用被显著减弱;6Gy的辐射剂量可显著促进MG-63细胞的凋亡水平增加,给予MG-63细胞缺氧预处理后,辐射损伤对于细胞凋亡水平的促进作用被显著减弱。结论:6Gy可有效抑制骨肉瘤MG-63细胞的增殖,增加细胞凋亡。缺氧微环境显著升高骨肉瘤MG-63细胞增殖、凋亡率降低。缺氧微环境可能在增强骨肉瘤细胞放疗抵抗中发挥重要作用。第二部分缺氧微环境诱导骨肉瘤细胞放疗抵抗的机制目的:研究缺氧微环境诱导骨肉瘤细胞放疗抵抗的具体机制,并对相关机制进行探讨。方法:分别培养人骨肉瘤MG-63细胞和经过低氧条件预处理的人骨肉瘤MG-63细胞。采用重组腺病毒体外转染,Western Blot方法,细胞免疫荧光技术检测细胞DNA损伤(γ-H2AX),MitoSOX染色检测线粒体ROS,检测线粒体膜电位(MMP),流式细胞技术,MTT细胞增殖实验,3-MA抑制自噬实验、凋亡和自噬水平。结果:缺氧预处理可产生以下效应:1)诱导MG-63细胞中自噬水平的升高;2)通过降低细胞辐射损伤密切相关活性氧(ROS)水平达从而降低DNA损伤;3)降低线粒体ROS的产生进而保护了线粒体功能;4)利用自噬抑制剂抑制骨肉瘤细胞自噬后,缺氧微环境对骨肉瘤细胞耐受辐射损伤的保护作用消失。结论:缺氧微环境通过诱导骨肉瘤细胞发生自噬,提高了骨肉瘤细胞耐受辐射损伤的能力,因而导致骨肉瘤细胞发生放疗抵抗。自噬可能介导了缺氧微环境对骨肉瘤细胞耐受辐射损伤的保护作用。第三部分缺氧诱导因子表达与骨肉瘤患者预后的相关性分析目的:研究缺氧诱导因子HIF-1、LC3-II及p62在人骨肉瘤组织中的表达,分析其与临床病理的关系,并探讨HIF-1在骨肉瘤发生和发展中的作用和意义。方法:采用免疫组织化学染色方法检测89例(平均年龄为22岁)骨肉瘤组织中HIF-1的表达水平,并在只接受手术和放疗的患者骨肉瘤标本中进一步检测了LC3-II及p62的表达水平。Kaplan-Meier分析比较HIF-1、LC3-II及p62高表达、中表达和低表达患者生存率之间的差异。结果:HIF-1在骨肉瘤组织中低中高表达比例分别为20.2%(18/89)、24.7%(22/89)、55.1%(49/89),且HIF-1的表达与Enneking分期(P<0.01)及远处转移(P<0.01)显著相关。而与其他临床病理特征之间无明显的关联。LC3-Ⅱ在36例术后只接受放疗的骨肉瘤患者中低中高表达比例分别为22.2%(8/36)、25%(9/36)、52.8%(19/36)。与此同时,52.8%(19/36)的骨肉瘤组织P62的表达水平较低,25%(9/36)中度表达,22.2%(8/36)高表达。且LC3-Ⅱ及P62的表达与Enneking分期(P<0.01),远处转移(P<0.01)及患者生存期显著相关。而与其他临床病理特征之间无明显的关联。结论:HIF-1、LC3-Ⅱ在骨肉瘤组织中高表达,而P62低表达。HIF-1、LC3-Ⅱ高表达,P62低表达提示临床预后较差。骨肉瘤患者组织中自噬水平的高低与放疗预后相关。