家蚕Bmserpin-15的功能初探与分析

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丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitors, SPIs)通过调控蛋白酶的活性在生物生理应答过程中扮演着重要的角色,serpin家族属于SPIs中重要的一个家族,已有的研究表明serpin类丝氨酸蛋白酶抑制剂家族在体液免疫(抗菌肽合成与血淋巴黑化)中起到关键作用。本研究主要研究了一种serpin类丝氨酸蛋白酶抑制剂(家蚕serpin-15,Bmserpin-15)的表达模式以及其在家蚕体液免疫中生物学功能。研究结果如下:  1.成功构建了原核表达质粒 pET-28a-Bmserpin-15,并在大肠杆菌中成功表达了融合蛋白,经检测成熟的目的蛋白分子量大小为45.4 kDa,和预测的分子量一致。在天然条件下利用Ni-NTA亲和层析纯化对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白,以此蛋白免疫新西兰大白兔获得抗Bmserpin-15多克隆抗体,并用于后续的功能分析;  2.实时定量PCR和Western Blot检测分析表明Bmserpin-15在5龄3天幼虫表皮、丝腺、脂肪体、中肠、马氏管、精巢、卵巢、血细胞、血淋巴中都有表达,且在脂肪体和丝腺中高表达,血细胞中表达量最低;  3.对5龄第3天家蚕幼虫分别注射热灭活大肠杆菌(Escherichia coli)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、白僵菌(Beauveria bassiana)、家蚕核型多角体病毒(B. mori nuclear polyhedrosis virus),利用实时定量 PCR检测脂肪体中Bmserpin-15的转录表达水平和Western Blot检测血淋巴中Bmserpin-15的蛋白表达情况。与注射PBS对照相比较,结果表明除E. coli以外,其他三种病原微生物的免疫刺激,都能显著的上调或下调Bmseprin-15 mRNA和蛋白水平的表达,但是上调或下调的时间和程度都不同;  4.利用表达纯化的Bmserpin-15蛋白与家蚕本底血淋巴及M. luteus孵育检测 Bmserpin-15对家蚕血淋巴 proPO激活及 PO活性的影响。结果表明表明Bmserpin-15蛋白能够抑制血淋巴proPO的激活,但是对PO活性没有影响;  5.将Bmserpin-15蛋白和BSA(作为对照)分别注射进家蚕幼虫体内,30 min后注射M. luteus刺激抗菌肽的表达,实时定量PCR检测抗菌肽的表达情况。结果表明脂肪体中抗菌肽cecropinD,gloverin2和moricin的表达在mRNA水平上具有显著性的降低,说明Bmserpin-15蛋白能够显著地抑制AMPs基因的转录表达水平。  综上所述,本研究的结果表明Bmserpin-15在家蚕的先天性免疫应答中可能扮演重要的角色,为进一步从分子水平上解释serpin与家蚕先天性免疫的关系,以及对家蚕和鳞翅目昆虫的先天性免疫调控作用机理的研究具有重要的参考意义。
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