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研究目的骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种软骨磨损破坏和滑膜炎症为主的慢性退行性疾病。因关节软骨没有血管,软骨细胞再生能力较弱,受损的软骨很难修复。OA发病与年龄、肥胖、职业、基因多态性、激素水平等多种因素有关,其发病过程复杂,具体机制尚不明确。目前治疗OA常用方法有非药物辅助治疗、药物治疗、手术治疗和新型的再生治疗法。但前三者均以缓解病情,改善功能为主,而再生治疗法有希望修复受损的软骨。再生治疗法包括关节腔注射干细胞法、软骨组织工程法和为骨折术,但后两者还需要手术来完成。关节腔注射干细胞是最为便捷的方法。关节腔注射所用的干细胞一般都是间充质干细胞(MSCs)。在较多种干细胞中脂肪组织来源干细胞(adipose tissue derived stem cells,ADSCs)由于其来源丰富、取材方便、含量高等优点,已成为研究最多的干细胞。多项研究证实关节腔注射ADSCs治疗OA的有效性,但目前还是在研究阶段,并没有在临床上广泛应用,仍有较多问题需要解决。已有的动物实验和临床研究主要集中于自体来源ADSCs,同种异体体外扩增的ADSCs治疗OA的研究并不多。ADSCs不表达主要组织相容性复合体-Ⅱ(major histocompatibility complex,MHC-Ⅱ),可以同种异体使用。与患者自体来来源ADSCs相比,同种异体ADSCs可从健康人脂肪组织中分离扩增,制备成干细胞制剂而直接使用。同种异体体外扩增的ADSCs治疗OA的安全性和有效性需要进一步研究。OA环境中高浓度活性氧和炎症因子会使的ADSCs凋亡,降低ADSCs在关节腔内存活率从而降低其疗效。目前临床研究一般透明质酸(hyaluronic acid,HA)溶液或患者自体富含血小板的血浆(platelet-rich plasma,PPR)作为干细胞媒介提高其在关节腔内存活率。但HA有关节腔内滞留时间短,降解产物可能加重炎症的风险,而PRP有成分复杂,制备方法不统一的问题。因此研究一种成分较简单并且稳定性更好的媒介物极为重要意义。黄原胶(xanthan gum,XG)是水溶性微生物杂多糖,有较好的稳定性,其高粘弹性和假塑流变学特性与HA相似,并且对高温、酶和pH稳定。我们实验室前期研究证明关节腔注射XG能有效缓解OA病情并在关节腔内半衰期比HA长。有研究报道XG对干细胞生长无毒性,并能支持干细胞生长在交联XG孔径中;胚胎干细胞在XG与磁微球制备支架上向神经细胞分化。所以我们猜测XG是否可以成为ADSCs治疗OA的有效媒介物,开展了以XG为媒介的干细胞治疗OA的可行性研究。研究方法1大鼠ADSCs的分离、培养和鉴定用Ⅰ型胶原酶消化法从大鼠腹股沟及腹部皮下脂肪分离ADSCs,在标准细胞培养条件下进行培养;倒置相差显微镜观察ADSCs形态,用流式细胞仪检测ADSCs表面抗原,诱导ADSCs向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化进行鉴定。2体外研究XG对ADSCs增殖活性的影响用不同浓度XG处理ADSCs,显微镜观察XG对ADSCs形态影响;采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测XG对ADSCs毒性及增殖的影响;结晶紫染色检测XG对ADSCs克隆形成的影响;Muse细胞周期检测试剂盒测定XG对ADSCs细胞周期的影响。3体外研究XG对过氧化氢诱导的ADSCs凋亡的保护作用ADSCs用不同浓度XG预处理再用过氧化氢诱导凋亡,同时继续用XG干预处理。采用SEM观察ADSCs形态变化;TUNAL法检测DNA断裂;Annexin V标记和Hochest33258染色细胞核检测细胞凋亡;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧的水平;MitoTracker Red CMXRos荧光探针检测细胞膜电位转换。4同种异体体外培养的ADSCs治疗OA的研究制备大鼠前交叉韧带切断(ACLT)诱导的OA模型:大鼠右腿进行前交叉韧带切断手术,分别手术后2、4、8和12周处死大鼠,取关节对关节软骨进行大体观察和组织病理学观察评价软骨损伤程度。大鼠ACLT手术4周后,制备骨关节炎的大鼠随机分为2组:ADSCs治疗组和对照组,每组20只。ADSCs治疗组的大鼠右关节腔注射用PBS 60 μL混悬的1×106个同种异体体外培养的ADSCs,对照组大鼠右关节腔注射PBS 60 μL。实验过程中对大鼠的精神、饮食、粪便、活动、关节局部等状态进行观察。手术8周后每组分别取10只大鼠分别用游标卡尺检测膝左右关节宽度,左膝关节为正常组,并作记录,然后处死动物,对关节软骨骨进行大体观察和组织病理学观察以评价软骨损伤程度。手术12周后剩下的大鼠用游标卡尺检测膝左右关节宽度,左膝关节为正常组,并作记录,再从颈动脉窦取血检测血液学和血生化指标。处死动物,对关节软骨进行大体观察和组织病理学观察以评价软骨损伤程度。体外培养软骨细胞,用IL-1β处理制备OA体外模型,与ADSCs共培养,RT-PCR 检测软骨细胞 TNF-α、IL-6、IL-10、MMP-3 和 MMP-13 的 mRNA 水平。5 XG为媒介的ADSCs治疗OA的研究大鼠ACLT手术制备OA模型4周后,随机分为4组:XG-ADSCs治疗组、ADSCs治疗组、XG组和对照组,每组12只大鼠。XG-ADSCs治疗组大鼠右关节腔注射用1%XG 60 μL混悬的1 × 106个同种异体体外培养的ADSCs进行治疗;ADSCs治疗组大鼠右关节腔注射用PBS 60 μL混悬的1 × 106个同种异体体外培养的ADSCs进行治疗;XG组大鼠右关节腔注射1%XG 60 μL;对照组大鼠右关节腔注射PBS 60 μL。给药治疗后分别在1、2、3和4周检测后足支撑力评价疼痛;治疗4周后处死动物,取关节软骨,对关节软骨进行表面大体观察和组织病理学观察以评价损伤程度。关节软骨组织Ⅱ型胶原和MMP-13免疫组织化学染色评价Ⅱ型胶原和MMP-13的表达量;ELISA检测关节滑液中TNF-α、IL-1β、MMP-3 和 MMP-13 含量。为检测ADSCs在关节腔内存活率,用载有RFP-LucR基因的慢病毒感染进行标记制备FP-Luc-ADSCs,用小动物活体成像仪(Xenogen IVIS Lumina Imaging System)检测不同数量FP-Luc-ADSCs与生物发光强度的关系。ACLT手术4周后随机分为2组:XG-ADSCs组和ADSCs组。XG-ADSCs组的大鼠关节腔注射1%XG为媒介的1×106RFP-Luc-ADSCs,ADSCs组大鼠关节腔注射PBS混悬的1×106RFP-Luc-ADSCs,分别于1、7、14和28d将大鼠置于小动物活体成像仪内,检测生物发光强度。研究结果1成功分离培养ADSCsADSCs具有长梭型形态,高表达CD90和CD44,不表达CD45和CD11b;向脂肪细胞分化的ADSCs细胞能形成脂肪滴并能被油红O染色;向成骨细胞分化的ADSCs细胞内形成钙结节,茜素红S染色阳性;向软骨细胞分化的ADSCs高表达Ⅱ型胶原。2 XG对ADSCs生长具有促进作用并能抑制过氧化氢诱导的ADSCs凋亡XG对ADSCs生长无毒副作用,可浓度依赖性地促进ADSCs增殖和克隆形成;XG处理后ADSCs从GO/G1期进入S期和G2/M期。与单独H202处理ADSCs组相比,XG预处理后再用H202处理组凋亡率明显减少。XG处理抑制H202诱导的ADSCs细胞内活性氧水平和线粒体膜通透性转变。3成功制备ACLT诱导的大鼠OA模型大鼠ACLT手术后,大体观察和组织病理学检查结果表明,随着时间延长软骨损伤程度越来越严重;大体评分和Mankin评分结果表明,假手术组评分最低,手术后4、8和12周后随着时间的延长评分越来越高,与假手术组评分相比均显著性提高(P<0.01)。4同种异体体外培养的ADSCs对能有效缓解OA关节软骨损伤关节腔注射同种异体ADSCs治疗观察后未出现任何局部和全身反应;对照组和治疗组血液学和血生化指标无差别;8和12周后,ADSCs组膝宽和软骨损伤程度明显小于对照组,但随时间延长两组OA情况均加重。软骨细胞用IL-1β处理后TNF-α、IL-6、IL-10、MMP-3和MMP-13的mRNA水平明显升高。软骨细胞与ADSCs共培养抑制IL-1β诱导的TNF-α、IL-6、MMP-3和MMP-13的mRNA水平,升高IL-10的mRNA水平。5 XG为媒介的ADSCs能有效缓解OA病情与假手术组相比,PBS组大鼠右后腿足支撑力百分比显著降低;与PBS相比,关节腔注射XG-ADSCs和ADSCs右后腿足支撑力百分比显著升高,并维持4周(P<0.05),XG-ADSCs组提高水平显著高于ADSCs组(P<0.05)。XG也能提高右后腿足支撑力百分比,但两周后开始下降的趋势。关节软骨大体观察和组织病理学评价结果显示:不同处理组软骨损伤程度顺序为PBS组>XG组≥ADSCs组>XG-ADSCs组 假手术组;Ⅱ型胶原表达量顺序为假手术组≥XG-ADSCs组>ADSCs组≥XG组≥PBS组;MMP-13表达量顺序为PBS组>XG组≥ADSCs组>XG-ADSCs组≥假手术组;与假手术组相比,PBS组滑液中TNF-α、IL-1β、MMP-3和MMP-13含量明显升高;XG-ADSCs 和 ADSCs 治疗明显降低 TNF-α、IL-1β、MMP-3 和 MMP-13 的含量(P<0.05和P<0.01),XG也降低上述因子的水平但不显著,XG-ADSCs组降低水平显著高于ADSCs组和XG组(P<0.05和P<0.01)。活体成像生物发光强度与RFP-Luc-ADSCs数量成正比。关节腔第1 d,ADSCs组和XG-ADSCs组生物发光强度无差异;第7 d,XG-ADSCs组生物发光强度明显大于ADSCs组(P<0.05),与两组生物发光强度较第1d时均有所提高;14d时XG-ADSCs组生物发光强度明显大于ADSCs组(P<0.01),与第1 d和第7 d比较,两组生物发光强度均有所提高;28d时两组生物发光强度均减弱,XG-ADSCs组生物发光强度明还是大于ADSCs组,但不显著(P>0.05)。结论1.成功分离培养ADSCs,为后期研究做基础。2.XG对ADSCs无毒副作用,并能促进从G0/G1期进入S期和G2/M期而促进ADSCs增殖和细胞克隆形成。3.XG能抑制H202诱导的ADSCs细胞内活性氧水平、线粒体膜通透性转变和DNA断裂而抑制H2O2诱导的ADSCs的凋亡。4.关节腔注射同种异体ADSCs治疗OA未出现任何局部和全身毒副反应;在体外ADSCs通过旁分泌作用保护IL-1β刺激的软骨细胞。故ADSCs的OA治疗作用可能至少部分通过旁分泌作用实现的。5.关节腔注射XG为媒介的ADSCs能有效缓解OA疼痛、抑制OA软骨损伤,从而改善OA病情。XG-ADSCs组治疗OA的疗效优于单独应用ADSCs或XG的疗效。XG-ADSCs缓解OA的作用可能通过抑制OA过程中MMPs和炎症因子水平而实现。XG可能能通过促进ADSCs增殖,抑制ADSCs凋亡,从而提高ADSCs关节腔内存活率,提高ADSCs治疗OA的疗效。