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目的 腹主动脉瘤(Abdominal Aortic Aneurysm，AAA)是一种主动脉局限性扩张疾病，随着人口老龄化和饮食结构的改变，AAA的发病逐年增多。传统认为AAA是由感染、创伤和动脉粥样硬化等病因在一些促进因素如高血压、吸烟等作用下诱发的。但近年认为AAA是遗传学、环境、生物化学等多因素共同作用的结果。本病的最大危险在于瘤体不断生长而有随时破裂导致死亡的可能。虽然主动脉重建术和腔内隔绝术使临床上对瘤体直径较大的AAA能够进行有效的治疗，由于手术治疗的风险和局限性，目前对于瘤体直径较小、近期破裂几率较低的AAA不主张进行手术。但因其早期发病机制仍不十分清楚，这直接影响了对AAA的早期防治效果。随着基因技术的发展，基因治疗有可能在早期AAA的治疗中发挥重要作用。资料表明：动脉壁中巨噬细胞的浸润可以从产生MMPs等多方面促进AAA的发生、发展，而单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因对巨噬细胞浸润有着重要的调节作用，不仅可吸引单核细胞移动，而且可以调节血管内皮细胞粘附分子(如VCAM和ICAM等)的表达，在单核细胞粘附进入动脉壁中起重要作用。基因治疗中的反义技术能抑制有害基因的异常表达，具有重要的应用价值。微粒子载体是近年来发展起来的一种新型基因转移载体，可以容易地转入组织内、驻留其中并长期控释，在基因治疗的研究中具有光明的前景。本研究拟先探讨MCP-1基因在早期AAA发病中的作用，再通过构建以微粒子为载体的LNCX-anti-MCP-1基因转染体系，观察其在体内的转染情况，探讨微粒子作为基因转移载体的安全性和有效性。方法 实验中首先研究早期AAA发病中的基本机制。采用经腹主动脉腔内导管灌注的方法制成大鼠AAA模型，分别于术后3天、1周、2周、3周、4周获取各组大鼠腹主动脉标本，行弹力纤维特殊染色观察动脉壁弹力纤维的破坏情况;行CD68(巨噬细胞特异性抗原)免疫组织化学染色观察动脉壁中巨噬细胞的浸润;行MCP一1及MMP一2的原位分子杂交、Westem蛋白质印迹观察二者的mRNA表达和蛋白表达;分析MCP一1基因促进巨噬细胞的薪附、浸润在早期AAA发病中的作用。通过分子克隆技术构建以微粒子为载体的反义MCP一1基因转染体系，利用饰al和Clal双酶切载体LNCX后分别产生平末端和粘性末端，回收载体片段;再利用Smal和claI酶切pBS一SK+MCP一1质粒后也分别产生平末端和粘性末端，回收MCP一1片段，在毛DNA连接酶的作用下粘性末端和粘性末端(Clal)、平末端与平末端(HPal一Smal)相连接，可将MCP一1反向插人LNCX的多克隆位点，并在内部启动子的调控下，产生反义的MCP一1 mRNA序列;并进行重组质粒LNCX一anti一MCP一1的扩增与提取、进一步的酶切鉴定;用超声乳化法制备载反义MCP一1 DNA的微粒子基因转染体系，并观察其基本的物理特性。最后进行微粒子载体携反义单核细胞趋化蛋白一1基因的体内转染观察对腹主动脉瘤生长抑制作用，将大鼠制成腹主动脉瘤模型后，分成微粒子一DNA组和2个对照组，分别进行腹主动脉局部定位转染，2周后观察腹主动脉直径的变化，应用聚合酶链反应(PCR)观察微粒子做为基因转染载体的可行性，应用原位杂交、Westem蛋白质印迹等方法观察反义基因转染后对内源性MCP一1基因表达的抑制作用。结果 目前关于AAA的许多发病机制均是在成熟的AAA标本中得出的，无法得知AAA最初发病时的情况。与临床研究相比，动物模型在早期AAA发病机制的研究中具有明显的优势，本实验中成功建立了该模型。实验中观察到所有大鼠在灌注后即刻，腹主动脉均有扩张，但各组间差异无显著意义;至灌注后3d，腹主动脉呈缓慢扩张;随后动脉扩张呈加速状态，并于灌注后2周达峰值;此后，腹主动脉不再继续扩张。弹力纤维染色结果表明实验组于术后3天至1周，动脉内皮细胞、平滑肌细胞排列紊乱，部分弹力纤维扭曲、断裂;术后2周，动脉壁出现大量炎性细胞浸润，较多弹力纤维降解甚消失，动脉壁破坏明显;C D68蛋白于灌注后2周表达最强烈，与其他时段相比差异有非常显著意义(P<0.01.);MCP一1、MMP一2 mRNA表达于灌注后1周、2周时达高峰，分别为(29.6土4.9)%、(33.0土4.9)%，二者的蛋白表达均在术后2周时为最强烈，并显著高于其他时段(P<0.01)。在重组质粒构建的实验中，经扩增、提取转人DH5a的LNcx一anti一McP一1质粒后，用EeoRI酶切鉴定，出现了5 17bp、1.6kb、2.okb、3.Okb四条基因片段;经Hindlll酶切后出现了0.6kb和5.Okb两条基因片段;样品DNA的含量为1 6.23m扩血;用微粒子载体包载重组质粒后，扫描电镜观察携LNCX-anti一MCP一1质粒的微粒子直径均在350一soolun左右，大小均匀，呈圆球形，包封完好;DNA含量为4.4%。微粒子载体携反义MCP一1基因的体内转染实验中，提取的动脉组织基因组DNA经PCR扩增后，微粒子一DNA组于430 bp处可见特异性条带，而对照组均未见，各组心、肝、肺、肾组织DNA经PCR扩增后均未见特异条带;转基因组动脉直径明显小于2个对照组(P<0.01);原位杂交和 Westem蛋白质印迹结果表明微粒子一DNA组中MCP一1的mRNA及蛋白表达明显弱于2个对?