骨肉瘤是一种侵袭性的恶性骨肿瘤,主要影响青少年和年轻人,是儿童癌症死亡率的主要原因。虽然术前、术后的多药联合化疗使患者6年总生存率较单纯手术提高了约50%,但目前的化疗方案仍存在许多不足之处。这包括高复发率、强耐药性、化疗对正常组织的附带毒性,比如心脏损伤、中性粒细胞减少、血小板减少、贫血等严重副作用。事实上,目前的治疗方法已达到治疗极限,尽管在过去的40年中,全身化疗和外科技术取得了重大进展,但骨肉瘤的存活率在这段时间内也没有明显的提高。因此,有明确的证据表明,迫切需要开发疗效高、副作用少的新药物,以提供更好的治疗选择,改善预后。石蒜碱(Lycorine)是从石蒜科植物中提取的天然生物碱,具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗疟疾等多种生物学作用。在体外和体内均具有强大的抗肿瘤作用,其选择性细胞毒性在多发性骨髓瘤、宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、白血病和肝癌中均有体现。重要的是,在对正常细胞毒性最小的药物剂量下,观察到了石蒜碱的抗肿瘤作用。石蒜碱在抗肿瘤的作用上涉及了许多生物学机制,包括抑制蛋白质合成、诱导细胞周期阻滞和抑制细胞增殖,从而激活促凋亡级联反应等。细胞凋亡(程序性细胞死亡)是调节细胞生长和组织发育的关键,也是肿瘤抑制机制的关键。细胞凋亡通路的缺陷或失活是细胞向恶性转化的主要驱动力,使肿瘤细胞存活超过正常寿命范围,并使肿瘤细胞发生转移和对抗癌药物产生耐药性。由于凋亡在肿瘤发生中的重要性,针对靶向细胞凋亡的各个方面研发新的癌症治疗策略仍然是研究的热点。实际上,目前临床上使用的大多抗癌药物都是通过恢复细胞凋亡信号通路,使其向正常细胞状态转变,从而发挥其生物学作用,进而消灭恶性细胞来实现的。尽管有研究表明石蒜碱对多种癌症具有强大的抗癌作用,但其对骨肉瘤的作用尚未明确。因此,在本研究中,我们研究了石蒜碱对骨肉瘤在体外和体内的作用,以及石蒜碱发挥这些作用的机制。本课题从以下三个方面展开研究:第一部分,以骨肉瘤细胞系为研究对象,探究石蒜碱抑制骨肉瘤细胞增殖和诱导其细胞凋亡和细胞周期阻滞的作用。第二部分,探究石蒜碱发挥抑制作用的分子机制。第三部分,建立原位种植骨肉瘤细胞的小鼠模型,以组织学方法等进一步通过体内实验探究石蒜碱对骨肉瘤的抑制作用,验证体外实验结果。第一部分:石蒜碱抑制骨肉瘤细胞增殖和诱导骨肉瘤细胞凋亡及细胞周期阻滞的体外研究目 的:探究石蒜碱抑制骨肉瘤细胞增殖,诱导骨肉瘤细胞凋亡及细胞周期阻滞的作用。方 法:使用不同浓度的石蒜碱处理骨肉瘤细胞24小时和48小时,然后通过CCK-8法测量石蒜碱对骨肉瘤细胞增殖和细胞活性的抑制效果;采用克隆实验进一步探究石蒜碱对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用;使用不同浓度(0、2.5、5、10μM)的石蒜碱处理骨肉瘤细胞24小时,然后通过流式细胞术检测不同浓度石蒜碱对骨肉瘤细胞凋亡和细胞周期影响的剂量依赖性;使用10μM的石蒜碱处理骨肉瘤细胞不同时间长度(0、16、32、48h),然后通过流式细胞术检测石蒜碱诱导骨肉瘤细胞凋亡和周期阻滞的时间依赖性;通过Western blot检测石蒜碱处理骨肉瘤细胞后,细胞凋亡及周期调控相关蛋白的表达变化。结 果:在我们的研究中,我们初步确定了石蒜碱对骨肉瘤细胞的抑制作用,并测出石蒜碱对四种不同骨肉瘤细胞系的半抑制浓度;发现石蒜碱可以诱导骨肉瘤细胞的凋亡和细胞周期G1期阻滞;并发现石蒜碱对骨肉瘤的抑制作用具有剂量依赖性(即随着石蒜碱浓度的增加,其抑制作用更加明显)和时间依赖性(即随着石蒜碱处理时间的延长,其抑制作用更加明显);发现石蒜碱可以促进凋亡相关蛋白Bax的表达,caspase-3和PARP的剪切,以及周期相关蛋白P21的表达。结 论:石蒜碱可以诱导骨肉瘤细胞的凋亡,并可通过诱导细胞周期G1期阻滞抑制骨肉瘤细胞的增殖。第二部分:石蒜碱通过ROS/P38 MAPK信号通路诱导骨肉瘤细胞凋亡和G1期阻滞目 的:探究石蒜碱抑制骨肉瘤细胞增殖,诱导骨肉瘤细胞凋亡及细胞周期阻滞的分子机制。方 法:通过Western blot检测石蒜碱处理骨肉瘤细胞后的JNK、P38和ERK信号通路的变化,以及P53蛋白的磷酸化改变;通过免疫荧光实验检测石蒜碱处理骨肉瘤细胞SJSA-1和U20S后,P53蛋白的细胞定位情况;通过P38特异性抑制剂SB203580的使用验证石蒜碱对骨肉瘤细胞的抑制作用是通过P38信号通路发挥的;通过DCFH-DA的使用,检测石蒜碱对骨肉瘤细胞活性氧产生的影响;使用活性氧清除剂NAC,验证石蒜碱对骨肉瘤细胞的抑制作用可通过促进活性氧的产生发挥作用。结 果:石蒜碱处理骨肉瘤细胞后,促进了P38的磷酸化,而对JNK和ERK的磷酸化没有明显影响;石蒜碱对P38的磷酸化作用可以被P38特异性抑制剂SB203580部分拮抗,且SB203580可部分拮抗石蒜碱诱导的骨肉瘤细胞凋亡和G1期阻滞;石蒜碱可促进蛋白P53的磷酸化,并促进其进入细胞核;石蒜碱可以促进骨肉瘤细胞内活性氧的产生,且使用活性氧清除剂NAC可拮抗石蒜碱诱导的骨肉瘤细胞凋亡和G1期阻滞,以及拮抗P38和P53的磷酸化。结 论:石蒜碱对骨肉瘤的抑制作用,主要是通过促进骨肉瘤细胞内活性氧的产生,进一步激活P38信号通路,进而促进关键转录因子P53的磷酸化,从而促进凋亡蛋白Bax表达的增加,caspase-3和PARP剪切的增加而促进凋亡,促进细胞周期抑制蛋白P21表达的增加,从而促进G1期细胞阻滞。第三部分:石蒜碱抑制骨肉瘤的体内研究目 的:建立骨肉瘤荷瘤小鼠模型,以评估石蒜碱对于体内骨肉瘤的抑制作用。方 法:将骨肉瘤细胞U20S注射于BALB/c-nu小鼠背部皮下,建立原位骨肉瘤荷瘤小鼠模型。当小鼠背部肿瘤肉眼可见后,将小鼠随机地分为4组:对照组(PBS注射组)和3组石蒜碱处理组(5 mg/kg/d,10 mg/kg/d,15 mg/kg/d),每组6只。然后处理组小鼠腹腔注射相应剂量的石蒜碱,对照组小鼠注射等体积的PBS缓冲液,每天给药一次,连续给药25天。给药期间,每5天测量一次小鼠体重和肿瘤的体积。25天给药结束后,处死所有小鼠,将异种移植物的肿瘤组织小心的切除、并称重、液氮冷冻、后续蛋白提取或固定免疫组化分析。结 果:相比对照组而言,石蒜碱的处理能够抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长,降低肿瘤的体积和重量,抑制肿瘤增殖,诱导肿瘤凋亡;石蒜碱对心脏、肾脏、肝脏和肺组织无明显的细胞毒性作用。结 论:石蒜碱对体内骨肉瘤细胞同样具有抑制作用。