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哺乳动物卵巢卵泡发育是一个受诸多因素调节的生理过程。在卵泡发育过程中,绝大部分卵泡都中途闭锁、退化,只有极少部分原始卵泡发育成熟并成功排卵。研究表明,颗粒细胞的变化对卵泡的发育和闭锁起着至关重要的作用。近年来研究指出Smad4在颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁过程具有重要的调控作用。本试验以猪卵巢卵泡为研究对象,应用苏木素-伊红(HE)染色、放射免疫测定技术(RIA)、透射电子显微镜(TEM)、免疫组织化学(IHC)和蛋白质免疫印迹技术(WB),研究了猪卵巢卵泡闭锁过程中颗粒细胞形态学特征,同时探究了 Smad4在猪卵巢中的表达与定位情况,并进一步研究了不同健康状态卵泡颗粒细胞的Smad4磷酸化水平。研究结果丰富了猪生殖生物学内容,为进一步研究Smad4调控卵泡发育与闭锁的分子机制提供了依据。1.苏淮猪卵巢卵泡闭锁过程中顆粒细胞形态学研究为了研究苏淮猪卵泡闭锁过程中卵泡内部特征,采集150日龄猪卵巢,剥离直径为5～8mm的健康卵泡、早期闭锁卵泡和晚期闭锁卵泡,应用HE技术检测卵巢组织学和颗粒细胞形态学,应用RIA技术检测三种卵泡的卵泡液雌二醇(E2)和孕酮(P4)水平,应用TEM技术检测颗粒细胞的亚细胞结构。HE结果显示,150日龄苏淮猪卵巢同时存在原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡与闭锁卵泡。在健康卵泡中,颗粒细胞层紧密的分布在膜细胞内侧,卵泡腔完整,颗粒细胞正常存活状态下居多;早期闭锁的卵泡颗粒细胞层中已经有部分颗粒细胞开始脱落,凋亡小体开始出现,卵泡腔内出现凋亡颗粒细胞;晚期闭锁卵泡颗粒细胞层已经不存在,颗粒细胞散落于卵泡腔内,核染色质边缘化,颜色浓黑,许多凋亡细胞聚集成凋亡小体。RIA结果显示,伴随着卵泡闭锁,E2在三种卵泡液中的浓度显著降低(P<0.01);健康卵泡和早期闭锁卵泡的卵泡液中P4浓度差异不显著,晚期闭锁卵泡的卵泡液中P4浓度显著升高(P<0.05);伴随卵泡闭锁,P/E值显著升高(P<0.01)。TEM结果显示,健康卵泡中的颗粒细胞细胞膜完整,细胞器呈正常状态,细胞核膜完整;早期闭锁卵泡中的颗粒细胞线粒体已经开始发生肿胀,染色质开始固缩;晚期闭锁卵泡中的颗粒细胞线粒体已经完全肿胀呈现透明化,染色质完全固缩,细胞膜、核膜大多已破碎。这些结果表明卵泡闭锁过程中颗粒细胞结构也发生相应变化,为研究颗粒细胞参与调控卵泡发育与闭锁提供理论依据。2.Smad4在苏淮猪卵巢卵泡发育与闭锁过程中的表达与定位研究为了探究Smad4在苏淮猪卵巢卵泡发育与闭锁过程中的表达与定位,采集25、70和150日龄猪卵巢,应用免疫组织化学试验技术对Smad4蛋白进行定位研究;应用蛋白质免疫印迹技术对150日龄猪卵巢健康、早期闭锁和晚期闭锁三种卵泡Smad4蛋白表达和p-Smad4蛋白表达进行研究。结果发现,在25日龄母猪卵巢中,可见卵母细胞巢的存在,并同时观察到了原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡,未见有腔卵泡存在。Smad4在颗粒细胞和卵母细胞中均有不同程度表达,但是随着卵泡的发育,Smad4在卵母细胞中的表达逐渐减弱,颗粒细胞中的表达逐渐增强。在70日龄母猪卵巢中,卵母细胞巢不再存在,并观察到了原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡,仍未见有腔卵泡存在。Smad4主要在颗粒细胞上表达,而卵母细胞中基本不表达。在150日龄母猪卵巢中,同时观察到了原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、有腔卵泡(含闭锁卵泡)。Smad4主要表达在颗粒细胞中,随着卵泡的发育,颗粒细胞中表达也愈发增强。而当卵泡开始发生闭锁,伴随着颗粒细胞层解体,颗粒细胞凋亡散落于卵泡液中,Smad4在颗粒细胞中的表达也逐渐降低,早期闭锁卵泡的膜细胞上亦有Smad4表达。晚期闭锁卵泡中颗粒细胞已无Smad4表达。Western Blot结果显示,健康卵泡中Smad4表达量最高,随着卵泡的闭锁,Smad4蛋白表达量逐渐降低;进一步对不同健康状态卵泡颗粒细胞中Smad4磷酸化水平进行的检测结果发现,三种卵泡颗粒细胞中的p-Smad4也呈下降趋势,但在健康卵泡和早期闭锁卵泡内的差异不明显。这些结果为进一步研究Smad4及其磷酸化修饰参与调控猪卵泡发育与闭锁的作用机制提供科学依据。