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本文主要从以下几个部分进行论述： 第一部分 MSC旁分泌VEGF/HGF对肺微血管内皮细胞通透性影响的研究 目的：研究间充质干细胞(MSC)旁分泌血管内皮生长因子(VEGF)及肝细胞生长因子(HGF)对肺微血管内皮细胞(HPMECs)通透性的影响。 方法：将2×105人间充质干细胞(hMSC)在缺氧培养箱(0.5％O2，5％CO2，94.5％N2)缺氧培养24h，收集hMSC培养上清液(hMSC-CM)，然后预先用VEGF和(或)HGF抗体阻断hMSC-CM中VEGF及HGF。将2×105HPMECs种植到transwell小室上层，培养2-3天形成内皮细胞单层，然后将hMSC-CM与HPMECs共培养24h，再加入脂多糖(LPS)，检测以下指标:①hMSC-CM中VEGF和HGF浓度:采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法;②内皮细胞通透性:分别采用异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖法和FITC-白蛋白法检测HPMECs细胞旁及跨内皮细胞通透性系数;③内皮细胞通透性相关蛋白表达:采用Western blot检测内皮细胞连接VE-cadhein和Occludin蛋白表达、跨内皮细胞转运蛋白Caveolin-1表达;④内皮细胞凋亡及增殖检测:分别采用AnnexinⅤ-FITC/PI法和3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测内皮细胞凋亡及增殖。 结果：①LPS对内皮细胞通透性的影响:与0ng/ml LPS组比较，100ng/ml LPS明显增加HPMECs通透性，LPS浓度越高，增加内皮细胞通透性作用越明显(P＜0.01);LPS作用6h较对照组明显增加内皮细胞通透性，LPS作用时间越长，增加内皮细胞通透性作用越明显（P＜0.05或P＜0.01）;②hMSC对LPS损伤的内皮细胞通透性影响:与对照组比较，2×105hMSC明显降低LPS损伤的HPMECs通透性，hMSC细胞数量越多，对内皮细胞通透性的降低作用越明显(P＜0.05或P＜0.01);③hMSC分泌VEGF和HGF的作用:与对照组比较，LPS刺激及缺氧的条件下，hMSC分泌VEGF和HGF均明显增加（P＜0.05或P＜0.01）。④阻断HGF和（或）VEGF对hMSC-CM调节内皮细胞通透性的影响:与对照组比较，阻断HGF后，hMSC-CM对HPMECs细胞旁通透性的改善作用明显减弱(P＜0.05)，但阻断VEGF后，hMSC-CM对HPMECs细胞旁通透性的改善无明显影响(P＞0.05);分别阻断HGF和VEGF明显抑制hMSC-CM对跨内皮细胞通透性的改善作用(P＜0.05)。同时阻断VEGF和HGF后，hMSC-CM改善内皮细胞旁及跨内皮细胞通透性的作用都明显受到抑制(P＜0.01);⑤阻断HGF和（或）VEGF对hMSC调节内皮细胞通透性相关蛋白表达的影响:hMSC-CM被HGF抗体阻断后，其增加内皮细胞间连接VE-cadhein和Occludin蛋白表达的作用被明显抑制，同时阻断HGF和VEGF后，hMSC-CM的作用被进一步抑制(P＜0.05或P＜0.01); hMSC-CM被HGF或同时被HGF和VEGF抗体阻断后，其降低Caveolin-1表达的作用也被明显抑制(P＜0.05)。⑥阻断HGF和（或）VEGF对hMSC调节内皮细胞凋亡及增殖的影响:hMSC-CM分别被VEGF、HGF抗体或同时被HGF及VEGF抗体阻断后，hMSC-CM减轻LPS损伤的内皮细胞凋亡的作用明显受到抑制(P＜0.05或P＜0.01);而hMSC-CM被VEGF抗体或VEGF和HGF抗体同时阻断后，hMSC-CM增加内皮细胞增殖活力的作用也被明显抑制(P＜0.05)。 结论：①MSC旁分泌HGF改善肺微血管内皮细胞旁和跨血管内皮细胞通透性;②MSC旁分泌VEGF改善跨肺微血管内皮细胞通透性。 第二部分 RhoA/Rac1酶在MSC旁分泌VEGF/HGF调节肺微血管内皮细胞通透性的机制研究 目的：研究RhoA/Rac1酶在MSC旁分泌的VEGF和HGF调节肺微血管内皮细胞通透性的机制。 方法：2×105 HPMECs种植到transwell小室上层，培养2-3天形成内皮细胞单层，并在hMSC-CM和HPMECs共培养的基础上，使用RhoA抑制剂(C3转移酶)和Rac1抑制剂(NSC23766)，以及人重组的VEGF(rhVEGF)和rhHGF（与hMSC-CM相同剂量）。实验分为6组:①hMSC-CM组;②hMSC-CM+C3转移酶组;③hMSC-CM+NSC23766组;④rhVEGF/rhHGF组;⑤rhVEGF/rhHGF+C3转移酶组;⑥rhVEGF/rhHGF+NSC23766组。共培养24h，加入100ng/ml LPS作用6h，检测以下指标:①内皮细胞RhoA/Rac1酶活性:pull down法检测内皮细胞RhoA酶和Rac1酶活性;②内皮细胞通透性:采用FITC-葡聚糖和FITC-白蛋白法分别检测HPMECs细胞旁及跨内皮通透性系数;③内皮细胞通透性相关蛋白表达:采用Western blot法检测内皮细胞连接VE-cadhein和Occludin蛋白表达，以及跨内皮转运蛋白Caveolin-1表达。 结果：①hMSC旁分泌HGF/VEGF对内皮细胞RhoA/Rac1酶活性影响:与对照组相比，hMSC-CM明显抑制内皮细胞RhoA酶活性和增加内皮细胞Rac1酶活性。然而，预先使用HGF抗体或同时使用VEGF/HGF抗体阻断后，hMSC-CM的作用被明显抑制，但使用VEGF抗体阻断对hMSC-CM的作用无明显影响:②RhoA/Rac1酶抑制剂对内皮细胞RhoA/Rac1酶的活性的影响:RhoA酶抑制剂C3转移酶明显抑制内皮细胞RhoA酶活性，Rac1酶抑制剂NSC23766抑制内皮细胞Rac1酶活性;③RhoA/Rac1酶抑制剂对hMSC-CM及rhVEGF/rhHGF调节内皮细胞旁通透性的影响:与对照组相比，NSC23766预处理后，hMSC-CM改善内皮细胞旁通透性的作用被明显抑制，rhVEGF/rhHGF降低内皮细胞旁通透性的作用也被明显抑制。④RhoA/Rac1酶抑制剂对hMSC-CM及rhVEGF/rhHGF调节跨内皮细胞通透性的影响:与对照组相比，NSC23766预处理内皮细胞后，hMSC-CM改善跨内皮通透性的作用被明显抑制，rhVEGF/rhHGF降低跨内皮通透性的作用也被明显抑制。⑤RhoA/Rac1酶抑制剂对hMSC-CM及rhVEGF/rhHGF调节内皮细胞通透性相关蛋白表达的影响:与对照组比较，NSC23766预处理内皮细胞后，hMSC-CM及rhVEGF/rhHGF增加内皮细胞间连接VE-cadhein和Occludin蛋白表达;降低跨内皮转运Caveolin-1蛋白表达的作用被明显抑制。 结论：①Rac1酶可能是MSC旁分泌VEGF/HGF改善肺微血管内皮细胞通透性的重要途径;②RhoA酶不参与MSC旁分泌VEGF/HGF改善肺微血管内皮细胞通透性。 第三部分 接触内皮细胞对MSC旁分泌HGF调节肺微血管内皮细胞通透性影响的研究 目的：研究MSC与内皮细胞(MSC-EC)接触对MSC旁分泌HGF调节肺微血管内皮细胞通透性的影响。 方法：5×104人肺微血管内皮细胞(HPMECs)种植到transwell小室上层，培养2-3天形成内皮细胞单层，小室下层采用两种不同共培养模型:①MSC-EC接触培养:小室下层加入1×105 hMSC和1×105 HPMECs;②hMSC培养:加入1×105hMSC。继而加入100ng/ml HGF抗体共培养24h，然后加入100ng/ml LPS刺激6h。检测以下指标:①培养液中HGF浓度:ELISA检测培养液中HGF浓度;②内皮细胞通透性:采用FITC-葡聚糖和FITC-白蛋白法分别检测HPMECs细胞旁及跨内皮细胞通透性系数;③内皮细胞通透性相关蛋白表达:采用Western blot法检测内皮细胞连接VE-cadhein蛋白表达、跨内皮转运蛋白Caveolin-1表达。④内皮细胞增殖:BrdU法检测HPMECs增殖能力。 结果：①MSC-EC接触对hMSC调节内皮细胞通透性的影响:与hMSC组相比，MSC-EC接触组内皮细胞旁和跨内皮细胞通透性均明显降低;②MSC-EC接触对hMSC分泌HGF的影响: MSC-EC接触组培养液中HGF浓度明显高于hMSC组:③阻断HGF对MSC-EC接触调节内皮细胞通透性的影响:阻断HGF后，MSC-EC降低内皮细胞旁通透性和跨内皮细胞通透性的作用被明显抑制。④MSC-EC接触对hMSC调节内皮细胞通透性相关蛋白表达的影响:与hMSC相比，MSC-EC接触组内皮细胞连接VE-cadhein及Occludin蛋白表达明显增加，而跨内皮细胞转运蛋白Caveolin-1表达明显降低;然而使用HGF抗体阻断后，MSC-EC调节内皮细胞通透性相关蛋白表达的作用被明显抑制。⑤MSC-EC接触对hMSC调节内皮细胞增殖的影响:MSC-EC接触组内皮细胞增殖能力明显高于hMSC组，但阻断HGF后，MSC-EC促进内皮细胞增殖的作用被明显抑制。 结论：接触内皮细胞增强MSC旁分泌HGF改善肺微血管内皮细胞通透性。