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目的:作为2型糖尿病主要微血管并发症之一,糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)已成为终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的首要病因。白蛋白尿目前是DKD的主要临床诊断标准,同时也在促进DKD发生发展的进程中起着关键作用。早期研究表明尿蛋白对肾脏的损伤主要是由于尿蛋白引起足细胞和系膜细胞发生炎症和纤维化,最终导致肾小球硬化。然而近期研究发现过多尿蛋白造成肾小管间质纤维化及肾小管上皮细胞萎缩、凋亡,证实了肾小管的结构和功能受损在肾脏损伤过程中起着关键作用。自噬在多项研究中被证实具有肾脏保护作用,溶酶体功能正常是自噬完成的必要条件,但自噬-溶酶体途径在糖尿病肾病这一病理状况下如何改变及其具体机制仍未得到完全阐明。小檗碱(Berberine,BBR)是从中草药黄连中提取的异喹啉类生物碱,有报道指出BBR可改善糖尿病肾病足细胞损伤,然而其对尿白蛋白超负荷造成的肾小管损伤的作用仍不十分清楚。本研究以自发2型糖尿病动物模型-Zucker Diabetic Fatty(ZDF)大鼠和人肾小管上皮细胞(HK-2)为研究对象,旨在探讨:1.小檗碱对糖尿病肾病大鼠疗效研究。2.白蛋白超负荷对肾小管上皮细胞自噬及凋亡的影响及小檗碱的干预效果。3.白蛋白超负荷对肾小管上皮细胞溶酶体功能的作用及小檗碱干预效果。方法:1.以ZDF大鼠为研究对象,同周龄ZL大鼠作为对照组,给予高脂饮食喂养6周后,测定大鼠随机血糖并留取大鼠24小时尿测定尿微量白蛋白(urine microalbumin,UMA)。以2次或2次以上随机血糖≥16.7mmol/l作为2型糖尿病造模成功的标准,糖尿病造模成功且24小时UMA显著高于正常对照组视为DKD造模成功。糖尿病肾病造模成功后,将DKD大鼠随机分为糖尿病肾病模型组(DKD)和小檗碱干预组(DKD+BBR)。小檗碱干预3周后处死大鼠,生化法检测各组大鼠肝功能、血清肌酐、尿素氮等指标,生化法测定各组大鼠24h UMA和肾小管损伤指标。2.(1)以各组大鼠肾脏组织和HK-2细胞为研究对象,以不同浓度的牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)干预细胞24h,CCK-8测定各组细胞增殖活力。western blot法测定各组大鼠及细胞自噬相关指标LC3、p62的水平;western blot法检测AMPK(AMP-activated protein kinase)、m TOR(mammalian target of Rapamycin)的磷酸化水平。(2)自噬调节通路细胞实验:设置对照组(control组),白蛋白超负荷组(5mg/ml BSA),AMPK激动剂组(5mg/ml BSA+AICAR),m TOR抑制剂组(5mg/ml+Rapamycin),western blot法检测自噬相关指标LC3、p62的水平;western blot法检测AMPK、m TOR的磷酸化水平。(3)药物干预细胞实验:设置对照组(control组),白蛋白超负荷组(5mg/ml BSA),小檗碱干预组(BSA+BBR),小檗碱干预+AMPK抑制剂Compound C组(BSA+BBR+CC),凋亡检测盒测定各组细胞凋亡情况;western blot法检测自噬相关指标LC3、p62的水平;western blot法检测AMPK、m TOR的磷酸化水平。3.以各组大鼠肾脏组织和HK-2细胞为研究对象,细胞实验分组设置为对照组(control组),白蛋白超负荷组(5mg/ml BSA),小檗碱干预组(BSA+BBR),小檗碱干预+AMPK抑制剂Compound C组(BSA+BBR+CC)。提取各组大鼠及细胞总蛋白,western blot法测定溶酶体功能的主要调节因子转录因子EB(transcription factor EB,TFEB)磷酸化水平、溶酶体相关膜蛋白1(lysosome-associated membrane proteins 1,LAMP1)的表达水平;酶活性测定试剂盒测定溶酶体相关水解酶组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)、酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)的酶活性;western blot法测定CTSB、ACP的表达水平。结果:一、小檗碱对糖尿病肾病大鼠疗效研究1.成功建立大鼠DM及DKD模型:9周龄时,ZDF大鼠2次以上随机血糖≥16.7mmol/l,表明成功建立DM模型。11周龄时,ZDF大鼠2次以上随机血糖≥16.7mmol/l且24小时UMA显著高于正常对照组,表明成功建立DKD模型。与NC组大鼠相比,DKD组大鼠空腹血糖水平明显升高(P<0.05),而体重未见明显变化;与NC组大鼠相比,DKD组大鼠24h UMA水平明显增高,肾小管损伤指标N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-beta-D-glucosaminidase,NAG)、β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase,GAL)也明显升高(P<0.05)。2.小檗碱干预效果:与DKD组相比,小檗碱干预组大鼠24h UMA水平明显下降(P<0.05),同时对肾小管损伤指标NAG、GAL也有改善作用。小檗碱作用安全,对大鼠肝功能、肾功能未见影响(P>0.05)。二、白蛋白超负荷对肾小管上皮细胞自噬及凋亡的影响及小檗碱的干预效果1.与DM组大鼠相比,DKD组大鼠自噬相关蛋白LC3II/LC3I比值下降,p62表达增高,AMPK磷酸化水平下降,m TOR磷酸化水平升高(P<0.05)。2.与DKD组大鼠相比,小檗碱干预可上调大鼠LC3II/LC3I比值,下调p62表达,上调AMPK磷酸化水平,下调m TOR磷酸化水平(P<0.05)。3.白蛋白超负荷可导致HK-2细胞p62蛋白表达上调,LC3II/LC3I比值下调,AMPK磷酸化水平下降,m TOR磷酸化水平升高(P<0.05)。4.与白蛋白超负荷组(5mg/ml BSA)相比,AMPK激动剂和m TOR抑制剂均可上调HK-2细胞中LC3II/LC3I比值,下调p62蛋白表达水平,上调AMPK磷酸化水平,下调m TOR磷酸化水平(P<0.05)5.小檗碱可上调白蛋白干预的HK-2细胞中LC3II/LC3I比值,下调p62蛋白表达水平,上调AMPK磷酸化水平,下调m TOR磷酸化水平(P<0.05)。向小檗碱干预的HK-2细胞加入AMPK抑制剂Compound C,发现LC3II/LC3I比值下降,p62表达增高,AMPK磷酸化水平下降,m TOR磷酸化水平升高(P<0.05)。6.5mg/m L白蛋白干预后,HK-2细胞凋亡明显增加,小檗碱干预可减少白蛋白诱导的细胞凋亡。向小檗碱干预的细胞中加入Compound C,可逆转小檗碱抗细胞凋亡的作用(P<0.05)。三、白蛋白超负荷对肾小管上皮细胞溶酶体功能的作用及小檗碱干预效果1.与NC组大鼠相比,DKD组大鼠溶酶体功能调控的关键因子TFEB磷酸化水平升高,溶酶体膜蛋白LAMP1生成减少,溶酶体水解酶ACP、CTSB表达下降,ACP、CTSB酶活性下降。2.小檗碱干预可降低DKD组大鼠升高的TFEB磷酸化水平,上调LAMP1和溶酶体水解酶ACP、CTSB的表达水平,升高ACP和CTSB的酶活性。3.白蛋白超负荷可使肾小管上皮细胞中TFEB磷酸化水平升高,LAMP1表达减少,ACP和CTSB酶表达量减少,酶活性下降。3.小檗碱可下调白蛋白干预的HK-2细胞中升高的TFEB磷酸化水平,上调LAMP1和溶酶体水解酶ACP、CTSB的表达水平,升高ACP和CTSB的酶活性。4.向小檗碱干预的HK-2细胞中加入AMPK抑制剂Compound C,可升高小檗碱抑制的TFEB磷酸化水平,抑制小檗碱升高的LAMP1、ACP和CTSB表达,抑制小檗碱上调的ACP、CTSB酶活性。结论:1.小檗碱可降低DKD大鼠24h UMA,并减轻大鼠肾小管损伤。2.白蛋白超负荷可抑制自噬,造成肾小管上皮细胞凋亡增多。小檗碱可通过激活AMPK/mTOR通路改善DKD大鼠肾脏自噬障碍,减轻蛋白尿造成的肾小管上皮细胞自噬抑制和细胞凋亡。3.白蛋白超负荷可导致肾小管上皮细胞溶酶体功能损伤;小檗碱可通过上调TFEB的活性,上调白蛋白超负荷状态下HK-2细胞溶酶体功能,从而减轻蛋白尿对肾脏的损伤。