肺癌是目前严重危害人类健康与生命最大的恶性肿瘤之一,导致人类癌症相关性死亡的主要原因。以―铂类‖为主的联合化疗是治疗非小细胞肺癌晚期(III B期、IV期)传统治疗的重要基石和主要的手段。随着肺癌发生机制研究的逐步深入,肺癌的靶向治疗及免疫治疗现已成为晚期NSCLC的研究热点。以表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)为代表的分子靶向药物临床应用研究发现,其可明显改善晚期NSCLC的生存期,提高生活质量,且此类药物相关的心脏毒性、骨髓抑制、肝肾功能损害等不良反应明显减低,现已成为晚期NSCLC的研究热点。第一代EGFR-TKI应用最广泛,为可逆的EGFR酪氨酸激酶抑制剂,但是治疗平均9个月左右,只要EGFR-TKI治疗,都会出现耐药迹象,一旦出现耐药,疾病往往迅速进展。因此,如何解决EGFR-TKI耐药,对临床治疗是非常关键且棘手的问题。厄洛替尼(erlotinib)属于EGFR-TKI其中之一,具有可抑制并减缓肿瘤的生长,也有耐药问题,随着研究的深入,但其治疗及耐药机制和通路仍有有不清楚的地方。ROS是人体细胞的有氧呼吸及有氧代谢过程中所产生的活性氧簇,其密切参与多种生理及病理过程的调节。在某些环境大量ROS的产生,进而引起细胞内蛋白、细胞器等结构的破坏,可以诱导细胞死亡。因此,临床常用抗肿瘤的药物杀伤肿瘤细胞可以直接或间接地通过活性氧簇(ROS)来起作用。同时调节性T细胞(Treg)/调节性B细胞((Breg)作为一类具有独特的免疫负性调节功能的细胞亚群,在肿瘤的免疫耐受及治疗过程中逐渐被认识、利用。大量研究表明,Breg、Treg等免疫细胞在肿瘤微环境中起着免疫调控作用,其参与肿瘤细胞的存活、增值和转移。鉴于ROS是诱导肿瘤细胞死亡的重要因素、免疫细胞在肿瘤的免疫耐受及治疗中起着重要作用,有关EGFR-TKI诱导的ROS在抗癌中的具体作用和机制以及Treg、Breg等免疫细胞在肿瘤微环境中的调控机制目前还不完全清楚,亟待深入的研究来阐明,以此来开展肿瘤的新的分子生物治疗,以改善患者的预后。目的:厄洛替尼诱导非小细胞肺癌细胞凋亡的治疗的作用,并探讨其作用机制。第一部分实验研究厄洛替尼对肺腺癌细胞凋亡及增殖的影响及可能的机制,通过ROS介导JNK通路探讨厄洛替尼对该通路的调节作用,促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖,为肺腺癌治疗药物的作用机制及耐药研究提供理论基础。第二部分实验探讨调节性T淋巴细胞(regulatory T cell,Treg)各亚群和调节性B淋巴细胞(regulatory B cell,Breg)在EGFR阳性肺腺癌患者外周血中的表达水平及口服厄洛替尼药物的影响。方法:第一部分实验研究中,研究了ERL对人肺癌A549细胞的抗癌作用及其潜在的机制。MTT法检测ERL对A549的细胞活性的抑制作用。应用Hoechst33342染色和FACS测定法检测ERL诱导A549细胞凋亡作用;使用DCFH-DA荧光标记检测A549细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量,JC-1染色测量线粒体膜电位(MMP)。通过蛋白质印迹法(Western Blot)测定ERL对JNK蛋白的磷酸化状态和下游凋亡相关蛋白的的表达影响。第二部分实验研究中采集19例晚期肺腺癌患者和20例健康人的外周血样,通过流式细胞仪分析其外周血中Treg和Breg的比例,分别以CD4+CD25+标记Treg、以CD45RA、CD4、CD25来标记Treg亚群(r Treg,non-Treg,a Treg)、以CD 19+CD24hi CD27+标记Breg。结果:1体外实验发现ERL可以显著抑制A549的细胞生长,且呈现浓度依赖性。Hoechst33342染色证实ERL诱导人非小细胞肺癌细胞凋亡,与药物浓度相关。将肺癌A549细胞与不同浓度的ERL(0,5,10,15,20,25,30,35,40,45μmol/L)孵育24小时。MTT检测显示在体外不同浓度ERL对肺癌A549细胞的增殖产生不同程度的抑制作用,越高浓度的ERL对细胞增殖的作用越明显,说明ERL的抑制作用有浓度依赖性。我们的实验研究结果显示ERL对A549细胞的24h小时半数抑制浓度(IC50)为23.09μg/ml。Hoehcst染色结果显示,25μmol/L组的染色细胞出现细胞核的碎裂、大小不等的圆形小体,表现出调亡的状态。当浓度为45μmol/L时,细胞内调亡小体的形成,细胞破碎,呈高强度蓝色荧光。可见当加入不同浓度的ERL(0,5,10,15,20,25,30,35,40,45μmol/L)时,凋亡细胞的数量明显增加,并呈剂量浓度依耐性。不同浓度的ERL组间差异比较,有统计学意义(p<0.05),随ERL浓度的增大,凋亡细胞量逐渐增加。2 ERL通过增加A549细胞内ROS量的产生,激活促进细胞凋亡的JNK信号通路。在加入不同浓度的ERL刺激后,DCFH-DA荧光探针标记A549细胞内ROS量的变化。检测DCF的荧光强度发现,随着ERL浓度的逐渐增加,A549细胞内ROS的生成量明显增加,组间比较差异有统计意义(p<0.05)。表明ERL可以诱导A549细胞内ROS的产生,并对A549细胞内ROS的水平有显著的作用,同时这种作用随浓度的不同,其程度也不同,体现为浓度的依耐性。免疫蛋白印迹法显示ERL组与对照组相比,每个药物浓度上JNK水平并没有发生明显变化,但JNK磷酸化明显升高,以浓度依赖方式诱导A549细胞中JNK磷酸化。将条带的不同强度转换为光密度(OD)分析后,差异有统计学意义(p<0.05)。3我们发现ERL可以诱导细胞周期停滞在G0/G1期。磷酸化的JNK降低线粒体膜电位和下调抑制细胞凋亡基因Bcl-2的表达,促进细胞凋亡基因Bax的表达上调。此外,ERL诱导JNK的磷酸化进一步增加c-Jun和caspase-3的活化。流式细胞术采用JC-1染色观察A549细胞中的线粒体膜电位的影响。当线粒体膜的处于高电位状态时,JC-1浓聚于线粒体的基质中并形成聚合物样的结构。而当线粒体膜电位处于低电位状态时,JC-1为单体形式存在。通过流式细胞技术检测发现,ERL处理后A549细胞线粒体膜电位明显下降,也呈现为浓度依赖性关系。随着ERL的浓度升高,线粒体膜电位(MMP)的降低越明显,差异有统计学意义。流式检测细胞分期的结果发现,空白组G1期细胞比例分别为(52.27士3.00%),显著低于ERL组(81.03士7.88%)(p<0.05),而NAC预处理+ERL组G1期细胞比例明显低于ERL组,其数值(71.34士12.48%)。提示ERL可通过氧化应激反应进而干预A549细胞周期分布,引起G1期阻滞。在ERL经处理24小时后,与对照组相比,在ERL处理组A549细胞中Bcl-2的蛋白表达明显降低,Bax显著增加(p<0.05)。此外,与对照组相比,ERL处理组中Bcl-2/Bax蛋白的相对比例也有降低(p<0.05)。NAC处理后可以明显逆转上述ERL对Bcl/Bax表达比例失调。此外,ERL促进A549细胞中c-Jun的磷酸化,细胞内Caspase-3的活性增强。4所有ERL的促凋亡作用通过ROS清除剂NAC应用而逆转。为了进一步证实ROS的水平变化是ERL引起的重要靶点,我们实验采用抗氧化剂乙酰半胱氨酸(NAC)从对立面进一步证明。我们实验给药方案包括对照组1(空白+no NAC),ERL组(ERL25μmol/L+no NAC),对照组2(NAC)(空白+1mmol/L NAC),ERL+NAC组(ERL25μmol/L+1mmol/L NAC)在加入NAC干预后,细胞内的凋亡受到明显抑制:下调ROS的水平,逆转ERL的细胞周期阻滞效应,干预凋亡蛋白(例如Bcl-2,Bax和caspase-3)的活化。从而逆转ERL的促凋亡作用。5我们第二部分实验研究发现19例肺癌患者口服厄洛替尼,其中15例疗效评价为部分缓解,3例疗效评价为稳定。肺癌患者外周静脉血中血CD4+T淋巴细胞占PBMC的比例较正常对照组明显升高(p<0.001),同时静脉血中a Treg占CD4+T淋巴细胞的比例较正常对照组升高(p<0.05),Breg(CD19+CD24hi CD27+)占CD19+B淋巴细胞的比例较正常对照组明显升高(p<0.001)。靶向治疗有效患者,三群Treg及Breg水平均降低,但无统计学意义。结论:我们研究发现,体外实验表明ERL通过诱导A549细胞凋亡具有显著的抗癌作用,且呈现浓度依赖性。其作用的机制为ERL诱导A549细胞内ROS的产生,导致线粒体膜通透性改变,激活JNK蛋白表达,调控Bcl-2、Bax的表达比例,进而激活Caspase-3,通过线粒体介导的细胞凋亡途径导致肿瘤细胞凋亡。通过临床病例分析发现,肺腺癌患者外周血中存在Treg、Breg细胞比例的失调,其中a Treg亚群的比例升高,经体内活化增殖转变为终末分化状态的a Treg,募集至肿瘤组织局部,Breg的比例也表现为升高。Treg和Breg两类调节性淋巴细胞所参与的负性免疫调控来下调抗肿瘤免疫监控,从而有利于肿瘤的进展。经口服ERL的患者,Treg的亚群及Breg未见明显变化,需要临床大数据进一步明确。体内、外实验均表明ERL具有显著的抗肺腺癌作用,其对肿瘤发展过程中抑制作用及其分子机制尚未得到充分阐明。