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目的:观察利凡诺对来源于内胚层的肝细胞(BRL-3A)、来源于中胚层人脐静脉内皮细胞(HuVEC)和成纤维细胞(L929)的生长增殖能力的影响;对利凡诺抗血管生成的作用及机制进行初步探讨。
方法:借助倒置显微镜观察细胞在经不同药物浓度(3.13μg·ml-1,6.25μg·ml-1,12.5μgml-1)、不同作用时间处理后,细胞的形态学改变,同时在荧光显微镜下观察细胞中利凡诺的荧光强度。用噻唑蓝法(MTT)以及核仁组织区银染法(AgNOR)检测利凡诺作用后,各细胞的生存和增殖能力的改变。用鸡胚尿囊膜实验(CAM)检测利凡诺对活体组织血管生成的影响。流式细胞术检测了利凡诺作用后对HuVEC细胞凋亡及周期的影响。运用RT-PCR,免疫细胞化学及Western blotting的方法分别从mRNA水平和蛋白表达水平观察利凡诺作用后HuVEC的VEGF及VEGFR2表达影响。
结果:细胞学观察:利凡诺作用24h后,肝细胞(BRL-3A)以及成纤维细胞(L929)的形态无明显变化,人脐静脉内皮细胞(HuVEC)突起变细甚至消失,细胞生长速度变慢;伴随药物浓度的增大,单位面积细胞数逐渐减少;三种细胞内利凡诺自发荧光随着药物浓度的加大和时间延长,荧光趋强。MTT结果:显示利凡诺对三种细胞的增殖都有一定的抑制作用,其中对HuVEC细胞增殖能力的抑制强于另外两种细胞(HuVEC vsBRL-3A,P<0.001;HuVEC vs L929,P<0.001)。在不同浓度利凡诺作用下,内皮细胞核仁组织区减少幅度较另外两种细胞更加明显,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。鸡胚尿囊膜实验显示利凡诺在体内也有显著的抑制血管生成作用,6.25μg·ml-1、12.5μg·ml-1用药组与NaCl组相比有显著差异。流式细胞术:利凡诺作用后对HuVEC细胞的凋亡无显著影响(P>0.05)。RT-PCR显示随着利凡诺用药浓度的增加,HuVEC细胞VEGF及VEGFR2的mRNA表达逐渐降低。免疫细胞化学方法查见:利凡诺作用48小时后,HuVEC细胞内VEGFR2随着利凡诺用药浓度的增加而降低。Western blotting检测HuVEC细胞内VEGFR2蛋白表达的变化趋势同免疫组化一致,随用药浓度的增高,蛋白表达降低。结论:利凡诺对来源不同胚层的三种细胞的增殖能力均有抑制作用,其中对HuVEC细胞的抑制尤其显著,提示该药对内皮细胞生长增殖的抑制较为特异。利凡诺能通过降低内皮细胞的VEGF及VEGFR2的mRNA表达,抑制VEGFR2的蛋白表达,而发挥抗血管生成的作用。而利凡诺对HuVEC细胞凋亡途径可能无明显影响。