【摘 要】
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蛋氨酸裂解酶为多功能酶,能够催化L-蛋氨酸、L-半胱氨酸以及同型半胱氨酸等多种物质。可广泛应用于癌症的辅助治疗以及心血管疾病的辅助诊断。本文成功构建毕赤酵母表达系统,
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蛋氨酸裂解酶为多功能酶,能够催化L-蛋氨酸、L-半胱氨酸以及同型半胱氨酸等多种物质。可广泛应用于癌症的辅助治疗以及心血管疾病的辅助诊断。本文成功构建毕赤酵母表达系统,获得蛋氨酸裂解酶纯品,并对其相关酶学性质和在检测试剂盒的应用方面行了探索。以人阴道毛滴虫mRNA为模板,克隆出蛋氨酸裂解酶基因,构建毕赤酵母表达载体pPIC9K-mg11,测序正确后转化到GS115中,筛选得到高拷贝重组菌株。诱导表达重组蛋白,优化表达条件,得到最佳pH值为6.0,最佳诱导温度为28℃,最佳甲醇添加量为0.5%。纯化后蛋白纯度大于85%,纯化回收率大于52.8%,每升发酵液可以获得60.42mg重组蛋白。酶对L-蛋氨酸、L-半胱氨酸、同型半胱氨酸为底物的比活力为0.77μ mol/min/mg,0.83476μmol/min/mg,1.19863μmol/min/mg;Km值分别为0.432mM,1.98mM,2.36mM。最适酶活性条件为35℃至37℃,pH值为6.0至7.0。利用酶活性检测原理,组装同型半胱氨酸检测试剂盒,试检测结果与商品化试剂盒检测结果无定性上的差异。为同型半胱氨酸检测试剂盒国产化及癌症的临床辅助治疗、心血管疾病的早期诊断和预防打下扎实的基础。
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