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近20年以来,现代生物技术快速发展并取得了一系列重大科技的进展和突破。尤其在医疗行业,基因工程制药的发展已经为人类的健康做出重大的贡献。其中,豹蛙抗瘤酶（ONC）是一种天然杀伤肿瘤细胞的核糖核酸酶。具有很强的肿瘤杀伤力,目前在很多体内外的肿瘤研究中得到了很好的进展,但临床试验中使用的豹蛙抗瘤酶均提取与蛙卵和早期胚胎中的天然提取物,来源有限,获取困难,产量相对较少,难以实现临床需求。另一方面,已知人血清白蛋白（HSA）具有有酵母高表达的特性。把ONC与HSA两者作用结合起来,制备出一种既高活性又高表达的融合蛋白,将产生巨大的社会效益以及促进医疗行业的进步。由此,本实验室研究组已经从构建了融合蛋白HSA-ONC中得到了高表达的融合蛋白HSA-ONC。为进一步的提高HSA-ONC的表达量、抗肿瘤活性和对肿瘤细胞的选择性,本文拟通过在HSA和ONC之间加上特定连接肽实现上述目标。本次实验是在已有融合蛋白连接肽（GGGGS）n基础上,插入本实验实构建的RKDRR序列片段,形成既有高度正负离子化又有高度亲水性的新型G4SRKDRRG4S连接肽。为了研究连接肽的作用,围绕构建表达融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC工程菌,表达融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC,分离纯化融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC,测定融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC的生物活性四个步骤展开实验,目的是达到不影响连接的两个蛋白活性的同时,又能保持甚至提高两个蛋白的表达量和对肿瘤细胞的选择性。在构建表达融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC工程菌时,利用本实验室构建的pPIC9K∕HSA和pPIC9K∕ONC重组质粒,用重叠PCR技术和阳性克隆筛选和鉴定构建重组（表达）质粒pPIC9K∕HSA-G4SRKDRRG4S-ONC及毕赤酵母工程菌GS115∕pPIC9K∕HSA-G4S RKDRRG4S-ONC,其次在表达融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC时,首先将GS115∕pPIC9K∕HSA-G4 SRKDRRG4S-ONC毕赤酵母工程菌进行扩大培养,进行诱导表达。诱导5d后,将发酵液离心,取上清按SDS-PAGE方法检测融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC的表达情况。然后在分离纯化融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC时,取含有融合蛋白HSA-G4SR KDRRG4S-ONC的发酵液上清进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,电泳结束后,根据目的蛋白在胶板中位置切下目的蛋白,匀浆,洗出目的蛋白,离心收集上清,真空冷冻干燥,得到融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC粉末,置于-80℃保存备用。最后在测定融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC的生物活性时,用0μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、0.8μM、1μM、1.5μM、2μM浓度的融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC处理体外培养24h大鼠肝癌细胞CBRH-7919,用MTT显色法检测药物处理48h后的细胞活性,结果表明对大鼠肝癌细胞CBRH-7919的半致死量(IC50)为0.39±0.14μM。用流式检测细胞周期相的分布和凋亡率,结果表明经融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC处理过的大鼠肝癌细胞CBRH-7919,处于G0/G1期的细胞比例比对照组高,而处于S期和G2/M期的细胞比例开始减少,融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC处理组的细胞凋亡率较对照组明显增加;用Western Blot检测细胞内Caspas8、BAX蛋白的表达变化,结果促进细胞凋亡相关蛋白Caspas8、BAX表达上调,说明融合蛋白通过调节细胞凋亡相关蛋白表达抑制肝癌细胞活性。综上所述,本实验通过设计了G4SRKDRRG4S连接肽,分离纯化该融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC并检测其生物学作用,发现融合蛋白对大鼠肝癌细胞的毒性强于正常细胞,并且通过调节细胞凋亡相关蛋白表达抑制肝癌细胞活性。