慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种常见的慢性炎症性呼吸系统疾病,其主要特点是呈进行性的、不完全可逆的气流受限,常常与气道慢性炎症反应、肺气肿和肺功能丧失相伴随;COPD的发病率和死亡率均较高,2018年我国患者人数已经突破一亿人,影响着全球人类的健康问题。COPD的病理机制非常复杂,炎症反应、氧化应激、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、免疫功能紊乱及细胞凋亡等在该病的发病过程中相互联系,相互影响,均发挥着关键作用。目前,COPD的临床用药主要包括支气管扩张剂、糖皮质激素、磷酸二酯酶抑制剂、抗氧化剂等几大类药物。这些药物单独或联合用药都能通过松弛平滑肌或抑制炎症反应对COPD患者起到较好的表面病症治疗效果,但同时对机体产生较大的毒副作用,也不能改变患者肺功能的衰退。因此,寻求更加安全有效的新型COPD治疗药物依旧非常重要。中药对防治COPD及其并发症的发生及发展、延缓肺功能损害及增强机体免疫力有较好的临床疗效。冬虫夏草作为一种珍贵的滋补强壮中药,具有补肺益肾等诸多药理活性;而通过发酵制备的人工虫草在保留野生虫草具有的药理活性的基础上,解决了野生虫草严重不足的难题,如临床应用于治疗COPD等呼吸系统疾病的人工虫草菌粉胶囊一一如金水宝胶囊,百令胶囊等。但是,对虫草抗COPD的有效成分、作用机制、体内生物标示物等方面鲜见报道。为了进一步提高虫草类药物在COPD治疗方面的科学性和有效性,本课题以临床上常用的人工虫草为原料药开展了人工虫草CPD0301抗COPD的有效部位的分离和活性筛选、作用机制以及体内生物标示物的研究。本课题的研究内容主要分为以下三部分:(1)人工虫草中抗COPD的有效成分的筛选,(2)抗COPD有效成分的药理活性及其作用机制的研究,(3)体内生物标示物的筛选及其在COPD模型大鼠中PK-PD关联性的探究。1、人工虫草CPD0301中抗COPD有效成分的筛选人工虫草CPD0301中抗COPD有效成分的筛选研究包括有效部位的提取分离与纯化、有效成分的定性定量分析、抗COPD的活性评价。将冬虫夏草菌粉按照m/v=1:10的比例溶于超纯水及95%乙醇中,100 W功率超声提取得到相应的水提物及醇提物。(1)水提物经过减压浓缩及冻干后,借助HPLC分析技术筛选出10种核苷类化合物并对其进行了定量分析,分析结果为胞苷0.753 mg/g,腺嘌呤 0.248 mg/g,鸟嘌呤 6.520 mg/g,尿嘧啶 0.215 mg/g,次黄嘌呤 0.252mg/g,尿苷 0.395 mg/g,腺苷 5.907 mg/g,2’-脱氧腺苷 0.576 mg/g,鸟苷 4.234 mg/g,胸苷0.376 mg/g,其中鸟嘌呤、腺苷和鸟苷含量较高;(2)醇提物经过乙酸乙酯萃取及大孔树酯柱层析、减压浓缩、重结晶及冻干后,借助GC/MS分析技术对甾醇类物质进行了定性分析,结果表明主要的虫草甾醇类成分是麦角甾醇,随后借助HPLC分析技术对麦角甾醇进行了定量分析,分析结果表明麦角甾醇含量约为5.547 mg/g;(3)乙醇提取后的虫草菌粉再次按照m/v=1:10的比例进行超纯水超声提取,经过醇沉、除蛋白、脱色等处理后,借助硫酸-苯酚法测定其中的多糖含量,分析结果为多糖含量约为4.4%。(4)通过CSE诱导RAW264.7细胞建立体外COPD炎症模型,以NO为评价指标初步评估了核苷类、甾醇类(麦角甾醇)和多糖类物质抗COPD的药理活性,结果表明三者均抑制了 CSE诱导RAW264.7细胞分泌NO的能力,且核苷类及甾醇类优于多糖类。鉴于大量文献报道了多糖类物质抗炎抗氧化的功效,后续实验主要针对核苷类和甾醇(麦角甾醇)展开。二、抗COPD有效成分的药理活性及其作用机制的研究抗COPD有效成分的药理活性及其作用机制研究的主要内容包括体内外COPD模型的建立、药理活性测定以及相关信号通路的探究。COPD的体外模型的建立是通过香烟提取物(CSE)刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞或人支气管上皮细胞16HBE,有效成分与细胞共培养24 h后,借助ELISA法和RT-PCR技术对细胞因子分泌及其mRNA表达水平等方面考察了人工虫草CPD0301中的有效成分对抗炎活性的影响;通过流式细胞技术测定了人工虫草中的有效成分对细胞中活性氧(ROS)水平、细胞表面相关抗原表达及细胞凋亡的影响;通过Western Blot法测定了相关的信号通路蛋白及凋亡相关蛋白的表达,探究了人工虫草中的有效成分对体外分子作用机制的影响。COPD动物模型的建立是通过连续3周、每周1次给老鼠腹腔注射CSE的方式建立;每天通过灌胃给药的方式喂给老鼠人工虫草CPD0301的有效成分,21天后处死老鼠并收集其肺灌洗液(BALF)、血浆及肺组织,通过瑞士-吉姆萨染色统计BALF中炎症细胞的浸润情况;通过酶试剂盒检测及ELISA法测定BALF和血浆中相应的氧化还原相关酶的活力及相关细胞因子的水平;通过HE染色及Masson染色考察人工虫草有效成分对肺组织的形态学影响;通过免疫组化法和Western Blot法测定人工虫草有效成分对动物体内的相关信号通路的影响。1、核苷类物质抗COPD的药理活性及潜在的作用机制研究核苷类物质抗COPD的药理活性及潜在的作用机制研究包括体内外炎症因子分泌、相关基因表达及信号蛋白调控等方面的研究。体外实验结果表明核苷类物质降低了 CSE诱导的RAW264.7细胞中NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症介质的分泌,抑制iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA的表达;体内研究显示核苷类物质改善了 COPD模型小鼠的肺组织结构,降低了小鼠BALF中炎症细胞的浸润,抑制了小鼠BALF及血浆中NO、TNF-α、IL-1β的分泌;体内外分子作用机制的研究均表明,核苷类物质升高了 SIRT1的表达,降低了 NF-κB/p65的表达,表明SIRT1-NF-κB/p65信号通路在核苷类物质的抗炎作用中发挥着重要作用。2、麦角甾醇对COPD的药理活性及潜在的作用机制研究麦角甾醇对COPD的药理活性及潜在的作用机制研究包括麦角甾醇体内外的抗炎、抗氧化、抗凋亡、影响细胞极化及蛋白酶表达等方面的研究。(1)体内外实验结果表明,麦角甾醇不仅抑制了 CSE诱导的16HBE细胞分泌NO、IL-6、TNF-α等炎症因子,降低了细胞中ROS水平,而且减少了炎症细胞在肺部的浸润,抑制了 BALF中氧化应激标志酶活力(CAT、MDA、SOD),进而发挥其抗炎、抗氧化的作用。此外,麦角甾醇抑制了 CSE引起的16HBE细胞凋亡及小鼠肺组织中的细胞凋亡,上调了抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达,下调了促凋亡相关蛋白Bax、Cleaved-caspase 3/7/9和Cleaved-PARP的表达,进而发挥了抗细胞凋亡的作用。麦角甾醇还抑制了信号蛋白NF-κB/p65的表达,说明NF-κB/p65在麦角甾甾醇发挥抗COPD的药理活性中发挥着重要作用。(2)巨噬细胞受到刺激容易发生细胞极化:M1极化(促进炎症)和M2极化(抑制炎症),在免疫调控中发挥着重要作用。实验结果表明麦角甾醇降低了 M1型细胞典型细胞因子(ROS,IL-6,TNF-α)及其相应 mRNA(iNOS,IL-6,TNF-α)的表达,增加了 M2型细胞典型细胞因子(IL-10,TGF-β)及其相应mRNA(IL-10,TGF-β)的表达;流式细胞术、免疫组化及Western Blot实验结果显示麦角甾醇减少了 M1型细胞典型表面抗原CD40的表达,增加了 M2型细胞典型表面抗原CD163的表达;上述实验结果均表明麦角甾醇能够促使RAW264.7细胞由M1型细胞向M2型细胞转变。此外,实验结果显示麦角甾醇能够激活HDAC3 mRNA及其蛋白的表达,抑制P300、CBP、PCAF mRNA及其蛋白的表达;麦角甾醇能够抑制蛋白激酶IKKβ的活性进而抑制NF-κB/p65的活化。综上,麦角甾醇能够通过HDAC3-NF-κB/p65信号通路调控巨噬细胞的极化,进而发挥抗COPD的治疗作用。三、体内生物标示物及CPD0301在COPD模型大鼠中PK-PD的关联性的探究。体内生物标示物以及CPD0301在COPD模型大鼠中PK-PD关联性的探究包括体内生物标示物的选择及其在COPD模型大鼠体内动力学参数的考察。经过对核苷类物质、多糖类物质及甾醇类物质等人工虫草CPD0301抗COPD的活性成分的初步筛选以及文献调研,最终确定麦角甾醇作为该抗COPD中药的体内生物标示物,并进一步以该物质为人工虫草CPD0301的生物标示物探究了其在COPD模型大鼠中的PK-PD关联性。结果表明,给COPD模型大鼠人工虫草CPD0301的量越大,血浆中生物标示物的含量越高,最高血药浓度Cmax及药-时曲线下面积AUC0∞也随之增大,随即药理活性越高。此外,蒸馏水溶解人工虫草CPD0301并按照450 mg/kg、一天三次的剂量给药后,大鼠血浆中生物标示物的 Cmax 为 15.74 ng/mL、AUC0-∞为180.941 ng/mL·h,而 20%羟丙基-β-环糊精溶解人工虫草CPD0301并按照1.35 g/kg、一天一次的剂量给药后,大鼠血浆中生物标示物的Cmax为97.50 ng/mL、AUC0-∞为1031.30 ng/mL·h,后者远高于前者;且单次给药时,后者达到最高血药浓度的时间明显延后。综上所述,本课题首先对人工虫草抗COPD的有效成分进行了筛选,借助HPLC、GC/MS及化学反应等分析手段分离确定了核苷类成分、甾醇类、多糖类等三类主要活性物质。随后,我们对核苷类和甾醇类(麦角甾醇)物质抗COPD的体内外药理活性和分子作用机制展开了系统的研究,结果表明核苷类物质具有较好的抗炎作用,可以减少炎症细胞的肺部浸润及炎性介质的释放;麦角甾醇在抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡、蛋白酶平衡及免疫调节等方面也具有显著的调控作用,表现为其可以抑制炎性细胞浸润及炎性因子的释放、降低氧化物水平并提高抗氧化酶活性、抑制凋亡相关蛋白的表达、抑制金属基质蛋白酶的活性及影响巨噬细胞的极化等。核苷类物质及麦角甾醇的作用机制均与组蛋白去乙酰化酶的活化及NF-κB/p65的抑制有关。最后,我们筛选出麦角甾醇为人工虫草CPD0301的体内生物标示物,并发现人工虫草CPD0301的羟丙基-β-环糊精混悬剂优于常规水溶剂,探究了其在COPD大鼠模型中的药代动力学特征。结果表明人工虫草发挥药理作用呈现浓度依赖性,且以20%羟丙基-β-环糊精为溶剂时AUC0-β提高、血药浓度达峰时间后延。总之,本研究为抗COPD虫草类药物的深入开发和临床研究提供了理论和实验基础。