目的:通过随机对照临床试验(RCT),观察秦艽地黄通痹汤治疗类风湿关节炎(RA)活动期的临床疗效,并运用网络药理学方法,对其作用机制进行分析。制备类风湿关节炎CIA大鼠模型,从基因转录和表达、相关信号通路的调控探讨秦艽地黄通痹汤治疗RA活动期的机制。方法:1.秦艽地黄通痹汤治疗RA活动期的临床疗效:根据RA活动期的诊断标准,设立纳入-排除条件,计算RCT样本量,招募72名患者。随机分为A、B两组,A组为对照组,予塞来昔布+甲氨蝶呤治疗。B组为实验组,予秦艽地黄通痹汤+塞来昔布+甲氨蝶呤治疗,两组均连续给药12周。观察两组治疗前后常见临床症状和ESR、CRP、RF、抗CCP等实验室指标的变化,比较VAS评分、DAS28评分和ACR20/50/70改善率。比较中医证候积分和中医有效率。同时监测秦艽地黄通痹汤的安全性。2.基于网络药理学分析秦艽地黄通痹汤治疗RA活动期的机制:提取秦艽地黄通痹汤全方有效成分并查找相应作用靶点,然后和RA致病靶点进行深度比对,构建“药物-有效成分-作用靶点-RA”关系图和PPI蛋白质相互作用图并对关键作用靶点蛋白进行数据挖掘。通过对GO功能富集分析和KEGG传导信号通路富集分析的研究,预测相关信号调控通路并通过对下游靶蛋白检测进行初步验证。3.秦艽地黄通痹汤对CIA大鼠基因转录和表达、相关信号通路的影响:制备类风湿关节炎CIA大鼠模型,将SD大鼠分为空白对照组(Ctrl组),CIA模型组(CIA组),MTX阳性对照组(A组)和MTX+秦艽地黄通痹汤组(B组),每组各10只。连续给药28天。观察大鼠一般状态和关节炎指数(AI)变化,制备大鼠关节组织病理学切片并观察滑膜和关节软骨的炎性改变。运用qRT-PCR和Western blot方法分别检测大鼠滑膜组织中TLR4、MyD88和 IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表达量以及 TLR4、MyD88、p-NF-κB(p65)、NF-κB(p65)蛋白表达量。结果:1秦艽地黄通痹汤治疗RA活动期的临床疗效:(1)收集满足纳入-排除条件的RA活动期患者72例。4例中途退出本研究。68例入组,A组35例,男13例,女22例,平均46.7±7.5岁;B组33例,男10例,女23例,平均48.1±6.3岁。两组基线资料比较,差异无统计学意义(P>0.05)。两组治疗前在关节压痛数、关节肿胀数、晨僵时间等常见临床症状;ESR、CRP、RF、抗CCP等实验室指标以及VAS评分,DAS28评分,中医症候积分比较,两组间差异无统计学意义(P>0.05)。(2)治疗后B组较A组在临床症状、实验室指标、VAS评分和DAS28评分上均显著好转,差异有统计学意义(P<0.01)。每组治疗后均较治疗前在临床症状、实验室指标、VAS评分和DAS28评分上均显著好转,差异有统计学意义(P<0.01)。但ACR20/50/70改善率比较,两组未及明显差异(P>0.05)。(3)在中医证候积分比较上,治疗后B组较A组显著降低,两组间差异有统计学意义(P<0.01);每组治疗后均较治疗前好转,差异有统计学意义(P<0.01)。治疗后中医有效率比较,A组88.6%,B组96.7%,B组改善较为明显,A,B两组间差异有统计学意义(P<0.05)。(4)秦艽地黄通痹汤的安全性监测,A组较B组不良反应明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。2.基于网络药理学分析秦艽地黄通痹汤治疗RA活动期的机制:(1)秦艽地黄通痹汤全方有效成分共68个,其中桂枝9个,白芍11个,防风21个,秦艽4个,生地黄5个,金银花24个,青风藤6个(部分中药同时含有数种有效成分)。根据有效成分得到作用靶点345个。检索RA疾病相关靶点655个。构建秦艽地黄通痹汤-RA的Venn图,发现重叠区域的关键作用靶点110个。通过Cytoscape3.6.1软件,构建“药物-有效成分-作用靶点-RA”关系图和PPI蛋白质相互作用图并发现IL6,TNF-α为关键作用靶点蛋白。通过GO-BP、GO-CC、GO-MF功能富集分析预测秦艽地黄通痹汤治疗RA主要通过免疫反应过程,涉及细胞微观结构并和细胞因子功能直接相关。通过KEGG信号通路富集分析预测秦艽地黄通痹汤可能通过干预NF-κB信号通路,调控下游靶蛋白达到治疗RA的目的。(2)对两组治疗前后血清标本中NF-κB信号通路下游靶蛋白水平进行检测,发现促炎因子水平显著降低(P<0.01),抑炎因子水平显著升高(P<0.01),NF-κB信号通路被抑制,初步验证了该结果。3.秦究地黄通痹汤对CIA大鼠基因转录和表达、相关信号通路的影响:(1)大鼠一般状态:CIA组大鼠体重明显减轻,精神萎靡,毛发枯黄,下肢活动逐渐减少。A,B两组大鼠一般状态较CIA组均改善,B组改善较为明显。(2)大鼠AI评分:和CIA组比较,A组1-3周,B组1-2周的大鼠AI评分无显著下降,差异未及统计学意义(P>0.05);A组4-6周,B组3-6周大鼠AI评分显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);和A组比较,B组1-3周的大鼠AI评分无显著下降,差异未及统计学意义(P>0.05),B组4-6周大鼠AI评分显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)番红O固绿染色的关节组织病理切片:和Crtl组比较,CIA组大鼠软骨细胞结构紊乱,关节面番红染色几乎完全丢失。A组大鼠关节软骨虽有轻度破坏,但较CIA组明显好转,关节软骨损坏评分明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。B组大鼠关节软骨较为完整,关节软骨损坏评分较CIA组和A组均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)基因转录和蛋白表达:和Crtl组比较,CIA组IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA和TLR4、MyD88 mRNA以及TLR4、MyD88和p-NF-KB(p65)蛋白表达量均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);药物治疗4周后,与CIA组相比,A,B两组IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA和TLR4、MyD88 mRNA以及TLR4、MyD88和p-NF-κB(p65)蛋白表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与A组相比,B组在上述相同mRNA和蛋白质表达量均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。各个组中,NF-κB(p65)含量的变化不显著,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:(1)通过RCT证实秦艽地黄通痹汤可以显著提高RA活动期患者的临床疗效,降低西药的毒副作用,具有减毒增效作用。(2)运用网络药理学方法成功预测了秦艽地黄通痹汤可能通过干预NF-κ B信号通路,调控下游靶蛋白达到治疗RA的目的。通过检测下游靶蛋白初步验证了预测结果。(3)制备类风湿关节炎CIA大鼠模型,进行体内动物实验,通过大体观察、组织病理学和分子生物学多种方法证实秦艽地黄通痹汤通过对NF-κB信号通路的调控达到治疗RA活动期的目的。