背景和目的：神经元型尼古丁乙酰胆碱受体（nAChRs）在调节大脑的功能中扮演着许多重要的角色。目前已经发现nAChRs除介导尼古丁成瘾外还与多种神经和精神系统疾病有关。nAChRs由多种不同的α或α和β亚单位组成，分布在神经系统的不同部位，具有不同的功能作用和药理学特性。含有α6亚单位的尼古丁乙酰胆碱受体（α6*-nAChRs）是其中的一类非常重要的受体，虽然在大脑中分布并不广泛，但其主要集中在中脑多巴胺能神经元所分布的区域，而这一区域与人的愉悦，奖赏和情绪控制，尤其是与药物成瘾有关，又称奖赏中枢。因此推测α6*-nAChRs可能参与调节中脑多巴胺环路相关的生理和和病理生理以及参与药物的奖赏和成瘾。然而，人们迄今对α6*-nAChRs的功能，药理和调节认知甚少，主要原因是目前尚无α6*-nAChR的选择性激动剂，且人为转染α6和其它β亚单位至细胞表达系统不能很好地形成具有功能的α6*-nAChRs。现在，美国Barrow Neurological Institute的Dr.Whiteaker lab已经成功地将功能性α6*-nAChRs转入人源SH-EP1细胞系，而且可以确定异源性表达功能性α6*-nAChRs的SH-EP1细胞系是研究α6*-nAChRs良好的细胞模型。黄连素是从黄连根中提取的一种天然的异喹啉类生物碱，又名盐酸小檗碱。它是中国传统的一味中药，具有良好的抗菌作用，主要用于治疗肠道细菌感染。但是，新近的证据表明黄连素可能还具有其他的一些新作用，包括治疗心律失常、糖尿病、高血脂和癌症。但是黄连素是否能影响尼古丁受体，是否能用于控制药物成瘾，尤其是吸烟导致的尼古丁成瘾，仍不清楚。本课题致力于研究黄连素对人源α6*-nAChRs的影响，以阐明黄连素的新作用及其机制，为进一步开发新型的戒烟药物提供实验证据。　　方法：　　实验对象　　1）转染的人源尼古丁受体：将α6(N-terminal)+α3(transmembrane domain)+β2β3(α6N/α3Cβ2β3 nAChRs,简写为α6*-nAChR)转入人源上皮肿瘤细胞系（SH-EP1）中使α6*-nAChRs稳定表达于培养细胞细胞膜上用于膜片钳记录。　　2）爪蛙卵细胞：α6(N-terminal)+α3(transmembrane domain and C-terminal)+β2β3或α6全段(N-terminal+transmembrane domain)拥有一个点突变+β2β3的DNA微注射入蛙卵细胞以表达功能性α6*-nAChRs用于双电极电压钳记录。　　3）C57BL/J6小鼠:成年雄性小鼠用于捡测黄连素对尼古丁引起的位置偏好反应。　　膜片钳全细胞记录　　在钳制电压为-40mV的条件下记录尼古丁引起α6*-nAChR所介导的全细胞内向电流反应，然后捡测黄连素对该电流反应的影响。　　双电极电压钳技术　　为了进一步研究药物作用位点，我们将突变体α6*-nAChRs导入蛙卵细胞，作为另一种细胞模型。在这个实验中我们使用双电极电压钳技术，将表达α6*-nAChRs的蛙卵细胞用Axoclamp900A放大器把电压维持在-70mV。药物溶于卵母细胞缓冲液通过16通道自重力灌流系统，通过自动阀门控制。　　药物通过计算机控制的U型管给药系统，可将药物快速灌流到细胞表面（～30ms）。胞内给药是将黄连素溶于电极内液中，当形成全细胞封接状态时，等待至少20分钟，以保证电极内液和和细胞内液进行充分对流交换，确保黄连素进入细胞内。　　条件性位置偏爱实验（Conditioned place preference,CPP）　　分为三组：（1）生理盐水+尼古丁为阳性对照组，（2）黄连素+尼古丁为实验组，（3）黄连素+生理盐水为黄连素对照组。黄连素给药方式为灌胃，剂量为20mg/kg。尼古丁为腹腔注射，计量是0.5mg/kg。生理盐水在（1）组为灌胃方式，容量同实验组的黄连素。生理盐水在（3）组为腹腔注射，容量同阳性对照组（2）的尼古丁。动物预适应3天，注射4天（每日二次），然后捡测CPP。　　数据的处理,分析和统计学　　使用Clampfit10.6、Excel、Origin8、GraphPad Prism7这些软件进行数据的离线分析。两组数据间比较用t-test，两组以上数据间比较用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。　　结果与结论：　　1）转入α6*-nAChRs的SH-EP1细胞系，可以作为研究黄连素对α6*-nAChRs药理学特性的模型细胞。　　2）尼古丁可以激活α6*-nAChRs产生全细胞电流，该反应可以被黄连素抑制，而且具有浓度依赖性。　　3）黄连素抑制α6*-nAChRs的药理学机制是一种非竞争型抑制，实验证明黄连素对α6*-nAChR的抑制在高浓度和低浓度尼古丁引起的反应是相似的。　　4）胞内给予GDP-βS（600μM）以阻断受体的内化，但不能抑制黄连素引起的抑制作用，说明此抑制作用不是由于α6*-nAChRs内化所致。　　5）黄连素对α6*-nAChRs的突变体（含有全α6的结构但拥有一个突变点）的抑制作用与SH-EP1细胞α6/α3的嫁接体α6*-nAChRs的抑制类似，这说明黄连素的作用位点可能是在α6*-nAChRs（N端）而不在α3-nAChRs的跨膜区上。　　6）条件性位置偏爱实验显示实验组的黄连素可以减轻由尼古丁引起的小鼠条件性位置偏爱作用。　　综上所述，本课题利用多种实验技术在不同水平的细胞和动物模型首次阐明了黄连素对α6*-nAChRs的拮抗作用及其作用机制。这一新发现将对理解黄连素的新的药理作用具有重要的理论意义并为开发黄连素成为一种新型的戒烟药物提供重要的实验基础。