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原发性肝癌,是我国最常见的恶性肿瘤之一,年死亡率居我国恶性肿瘤死亡率第三位。近年来,随着三维适型放疗及调强放疗技术的发展,放疗在肝癌治疗中发挥越来越重要的作用。放射治疗,简称放疗,是通过高能放射线照射来杀灭细胞的一种治疗方法。放射线辐射细胞后,激活细胞氧化应激反应,导致细胞凋亡。DNA降解是细胞凋亡的一个显著特征,也是辐射造成细胞损伤的主要目标。增加肿瘤细胞的辐射敏感性,可增加肿瘤的放疗疗效,辐射敏感性直接作用于细胞周期的G2期,使细胞周期阻滞于G2/M期,阻止细胞有丝分裂,诱导细胞凋亡。辐射敏感性受辐射敏感基因调控,多年来学者们致力于寻找肿瘤的辐射敏感基因,来增加肿瘤细胞的辐射敏感性,进而增强肿瘤的放疗疗效并减少放疗的副作用。IER5属于早期慢反应基因,由于IER5在细胞周期中的特定表达,故其在细胞周期调控中起一定作用。我们前期研究发现,辐射可增强IER5的转录水平,IER5表达增加可使离体培养人肝癌HepG2细胞对辐射损伤修复能力减弱,增加HepG2细胞的辐射敏感性。半胱天冬酶(caspase)是细胞凋亡的主要蛋白酶。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,能抑制半胱天冬酶-9(caspase-9)的活性,通过依赖和不依赖Caspase选择性地降低细胞活性致细胞凋亡。目前关于IER5在辐射诱导细胞凋亡中的作用及作用机制国内外尚乏报道。许多化疗药物主要通过激活caspase促进细胞凋亡。顺铂类化疗药物是肝动脉化疗栓塞的常用药物之一。IER5对顺铂诱导肝癌细胞凋亡是否有影响,国内外尚无报道。本文采用稳定转染筛选单克隆技术、免疫印记技术、流式细胞术等方法进一步探讨IER5与肝癌辐射敏感性之间的关系,研究其在辐射及顺铂诱导HepG2细胞凋亡中的作用及机制,期望为增加肝癌放化疗敏感性寻找到新的作用靶点,从而改善肝癌患者的预后及生存质量。目的：本研究以离体肝癌HepG2细胞为研究对象,采用稳定转染筛选单克隆技术,转染HepG2，建立IER5基因过表达细胞模型。采用细胞计数、MTT比色法、流式细胞术及蛋白免疫印迹技术研究IER5在辐射调控HepG2细胞增殖、存活、细胞周期分布及凋亡中的作用及作用机制。同时应用免疫印迹技术对IER5在顺铂诱导人肝癌HepG2细胞凋亡中的作用进行了研究。方法：1构建IER5过表达细胞系：用脂质体2000TM在人肝癌HepG2细胞内稳定转染IER5-3xFlag基因或空载体Pcmv-3xFlag Vector,构建稳定转染IER5基因的细胞系(HepG2/IER5),并将转染空载体的细胞(HepG2/Vector)作为对照组,采用免疫印迹法检测IER5蛋白表达。2研究IER5基因表达增加对辐射后HepG2细胞增殖、存活能力、细胞周期的影响：①将HepG2/IER5细胞和HepG2/Vector细胞分别接受0Gy、4Gy 60Co-γ射线照射,应用细胞计数方法检测IER5在辐射影响HepG2细胞增殖中的作用。②通过MTT法检测细胞存活率,研究IER5对辐射后HepG2细胞存活能力的影响。③采用流式细胞术研究IER5对辐射后HepG2细胞细胞周期的影响。3研究IER5在γ射线及顺铂诱导HepG2细胞凋亡中的作用及作用机制：采用蛋白免疫印迹方法检测凋亡蛋白和凋亡通路相关蛋白的表达。结果：1构建IER5过表达细胞系(HepG2/IER5)(见Fig 1):Western Blotting检测结果显示：相对于HepG2/Vector细胞,IER5蛋白在HepG2/IER5表达水平明显升高,说明HepG2/IER5过表达细胞系构建成功。2 IER5过表达能抑制HepG2增殖并增强辐射对HepG2细胞增殖的抑制作用(见Fig 2)：在未照射组及照射组,与HepG2/Vector细胞相比,HepG2/IER5细胞生长速度均明显减慢(P<0.05),说明增加IER5表达能抑制HepG2增殖,增强辐射对HepG2细胞增殖的抑制作用。3 IER5过表达加强了辐射对HepG2细胞存活的抑制作用(见Fig 3)：γ-射线照射后24小时及48小时HepG2/IER5细胞存活率明显低于HepG2/Vector细胞(P<0.01)。且辐射后24小时的HepG2/IER5细胞比未照射组HepG2/IER5细胞的存活率亦明显降低(P<0.01)。说明增加IER5表达能降低HepG2细胞存活率,增强辐射对HepG2细胞存活的抑制作用。4 IER5过表达能使辐射后的HepG2细胞周期阻滞在G2/M期(见Fig 4)：未照射组细胞及照射组HepG2/Vector细胞在各周期的DNA含量无明显差异；γ-射线照射后12小时(P<0.01)和24小时(P<0.05), HepG2/IER5细胞与对照组相比,随Go/G1期或S期DNA含量减少,G2/M期DNA含量明显增加。说明辐射后HepG2/IER5细胞周期被阻滞于G2/M期。5 IER5过表达能促进γ-射线及顺铂诱导的HepG2细胞凋亡(见Fig 5、6)：γ-射线照射或顺铂干预后,与HepG2/Vector细胞相比,HepG2/IER5细胞凋亡蛋白cleaved Caspase-3及cleavage PARP表达增强,说明增加IER5表达能促进辐射及顺铂诱导HepG2细胞凋亡。6 IER5通过增加辐射对Akt磷酸化活性的抑制作用、增加p21表达,促进辐射诱导HepG2细胞凋亡(见Fig 5)：γ-射线照射后,与HepG2/Vector细胞相比,HepG2/IER5细胞磷酸化Akt的表达减弱,p21表达增强,说明增加IER5表达能抑制Akt磷酸化活性、激活p21。结论：1建立IER5过表达细胞系(HepG2/IER5)及对照组细胞系(HepG2/Vector)2增加IER5表达能抑制HepG2细胞增殖,降低HepG2细胞存活率,增强辐射对HepG2细胞增殖、存活、细胞分裂的抑制作用。3增加IER5表达能增强辐射及顺铂诱导HepG2细胞凋亡。IER5可通过抑制Akt磷酸化活性,激活p21,增强辐射诱导HepG2细胞凋亡,而与p53、p73、Bcl-2、Bcl-x和Bax无关。本研究显示,IER5可能是肝癌放化疗的辐射敏感基因,对该基因进行深入研究,有可能为肝癌放化疗寻找到新的增敏靶点。