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随着人们对纳米技术探究的不断深入,纳米材料已经在生物分析化学领域得到了广泛的应用研究。以DNA为骨架的银纳米簇(DNA-AgNCs)作为一种新兴的荧光纳米材料,由于其独特的电子结构和优良的物理化学性质如尺寸超小、发光亮度高、荧光量子产率高、荧光发射可调、生物相容性好等,引起了广大科研工作者的研究兴趣。同时DNA-AgNCs的合成方法简单、成本低、毒性低,使得它们在细胞成像、生物标记和生物化学传感方面的应用逐渐增多,其中越来越多的荧光生物传感器利用DNA-AgNCs作为荧光检测信号探针,成功的实现对各种离子、小分子、核酸、蛋白质、癌细胞等分析物的测定。本论文旨在利用DNA-AgNCs作为荧光探针构建新型的生物传感器,分别应用于核酸内切酶EcoRI,人血色沉着病基因及人免疫缺陷病毒基因的检测,简要内容如下:1.概述了利用不同模板合成银纳米簇的方法及近年来基于DNA-AgNCs探针构建生物传感平台在荧光分析中的应用。2.含有不同C碱基数量的DNA合成出来的DNA-AgNCs的荧光性质差异很大,基于这一原理而建立了一种新非标记的方法用于特异性检测核酸内切酶EcoRI的活性和抑制剂筛选。实验设计了一条含有18个C碱基的DNA作为制备DNA-AgNCs的模板,在这18个C碱基之中每隔6个C碱基插入一段EcoRI的识别序列(GAATTC),从而形成一条长的C-rich DNA,另外再设计一条与C-rich DNA互补的G-rich DNA,两条单链DNA形成的双链DNA(dsDNA)可作为EcoRI的底物。体系中没有靶标EcoRI时,长的dsDNA中有C-richDNA,可以合成出荧光信号很强的DNA-AgNCs。当加入EcoRI之后,EcoRI会识别双链DNA上特定序列的位点并酶切,使得一条长链dsDNA被切断成六条短链DNA,导致由短链DNA合成的AgNCs荧光强度大大减弱,EcoRI的浓度与体系的荧光强度呈比例的变化,检测范围分别是4.34×10-4U·μL-1～1.74X10-3U·μL-1和2.17×10-3U·μL-1～1.09×10-2U·μL-1,检测限为2.1×10-4U·μL-1(S/N=3)。该传感器具有非常高的特异性,可以有效的区分其他非靶标的核酸酶。此外,体系成功的测定了 EcoRI抑制剂焦磷酸盐和5-氟尿嘧啶,其IC50值分别是2.33 mM和64.06 μM,同时将稀释的人血清作为实际样品进行加标回收率实验,获得EcoRI的回收率为96～102%,说明这种方法在药物筛选及疾病诊断方面具有巨大的应用潜力。3.本体系是基于DNA-AgNCs探针和核酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)辅助的循环放大方法检测核酸,该方法以人血色沉着病基因作为靶标DNA(T-DNA),设计了一个带有3’突出端的发夹DNA(MB)和一条单链的富C-DNA探针,其中MB的茎部含有可以识别T-DNA序列的区域和与C-DNA杂交的区域。当体系中存在T-DNA时,MB与T-DNA从3’端开始杂交形成3’平末端的双链DNA(dsDNA),由于3’平末端或3’凹末端的dsDNA均可作为ExoⅢ的底物,因此Exo Ⅲ可以对dsDNA中的MB茎部酶切,释放出T-DNA和MB中余下的DNA(R-DNA)。T-DNA可以循环反应,而R-DNA与C-DNA结合形成具有3’凹末端的dsDNA,因而激活了 Exo Ⅲ并将整条C-DNA完全水解,释放出R-DNA循环反应。通过不断的双循环反应,大量AgNCs的模板被水解成单个核苷酸,导致荧光DNA-AgNCs无法合成,因而体系的荧光信号很弱。若体系中没有T-DNA,则MB和C-DNA无法激活ExoⅢ,因而所有的DNA都可以稳定的存在,可以用C-DNA作为骨架合成出强荧光DNA-AgNCs,从而使得体系的荧光信号很强。体系的荧光强度值与T-DNA的浓度在200 pM～40nM之间存在线性关系,检测限是120pM(S/N=3),同时该方法具有高特异性,可以很好的识别单碱基错配DNA。该传感器还可以应用于实际人血清样品的检测,分别对三种不同浓度的靶标进行加标回收率实验,回收率在90-96.7%。表明该实验方法在临床诊断,基因检测,疾病的预防与治疗方面具有巨大的应用潜能。4.本文基于核酸外切酶Ⅲ二次循环放大构建了一种新型的DNA-AgNCs传感器用于人艾滋病毒基因(HIV-DNA)的灵敏检测。实验设计三种DNA,分别是长链DNA(X-DNA),辅助DNA(F-DNA)和富C的探针DNA(P-DNA)。其中X-DNA可以同时与两条F-DNA及一条HIV-DNA杂交形成大的双链DNA(dsDNA),P-DNA既可以与F-DNA杂交,又可以作为AgNCs的骨架。在靶标HIV-DNA存在下,靶标与X-DNA及F-DNA形成的3’端平末端双链DNA(dsDNA),激活Exo Ⅲ并酶解X-DNA,释放HIV-DNA进行循环反应,而F-DNA则进入下一步与P-DNA结合并开启Exo Ⅲ的酶切功能,P-DNA被破坏而无法合成DNA-AgNCs,释放的F-DNA依然能循环反应,导致大量的P-DNA被酶解,体系的荧光值大大的降低。如果体系内没有HIV-DNA则所有的DNA依然可以稳定的存在,最后加入AgNO3和NaBH4之后进行还原反应,合成出强荧光的DNA-AgNCs。本实验用“一锅法”实现了二次循环放大,增强了体系的灵敏度,HIV-DNA的线性范围是50pM～5 nM,检测限为35 pM(S/N=3),同时该方法具有优良的特异性,应用于实际人血清样品的加标回收率实验,靶标DNA的回收率在96.9%～104%。该实验操作简单,无需标记,成本低廉,方法灵敏,为人艾滋病病毒的研究提供一种新的检测手段。