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目的:代谢相关脂肪性肝病（Metabolic associated fatty liver disease,MAFLD）也称为非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）,是全球发病率最高的慢性肝病,全世界大约有四分之一的人深受该病困扰。MAFLD的预防和治疗主要依赖于饮食控制和运动干预,目前亟需开发新的和有效的治疗药物。AWRK6是基于东北林蛙皮肤分泌的天然多肽改造而来,前期研究发现AWRK6能够有效缓解高能量饮食诱导的小鼠MAFLD,而其中的调控机制尚不清楚。本研究使用油酸诱导肝细胞脂质累积,应用第二代高通量测序技术分析AWRK6处理后的miRNA差异表达谱,预测并验证差异表达的miRNA的靶基因,探究AWRK6缓解MAFLD的作用机制。方法:（1）采用0.5 m M油酸（OA）诱导培养HepG2细胞24 h,建立MAFLD体外模型,分别用梯度浓度AWRK6处理模型细胞24 h、48 h和72 h后,使用生化试剂盒检测细胞内甘油三酯（TG）的含量和CCK8实验检测细胞存活率,筛选优化AWRK6的合适作用条件。采用上述方法建立体外MAFLD细胞模型,分为NC组、MAFLD组（0.5 m M OA处理24 h）、MAFLD+AWRK6给药处理组（0.5m M的OA+0.5μM AWRK6处理24 h）、NC+AWRK6（0.5μM AWRK6处理24 h）组。制备单细胞悬液并用流式细胞仪进行细胞周期检测和细胞凋亡的检测,并采用实时荧光定量PCR技术（RT-q PCR）验证细胞周期蛋白CCNA、CCNB、CCND、CCNE的m RNA水平变化,以及免疫印迹试验（Western Blot）验证CCNA、CCNB、CCND、CCNE的蛋白水平变化。（2）采用上述方法建立体外MAFLD细胞模型,并用AWRK6最适作用条件处理:分为NC组、MAFLD组、MAFLD+AWRK6组。用Trizol提取各样本的总RNA,使用Nano Drop2000和琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度、浓度以及完整性。将质检合格的RNA采用Illumina Tru Seq Small RNA试剂盒构建文库,c Bot上进行桥式PCR扩增,生成clusters,Hiseq测序平台进行SE50测序。经由DEGseq软件进行各样本间的miRNA差异表达分析;使用Trizol提取NC组、MAFLD组、AWRK6组的总RNA,以茎环法反转录差异表达的miRNA成c DNA,并用实时荧光定量PCR技术（RT-q PCR）验证miRNA差异表达水平。（3）利用miRDB、Target Scan、Disease数据库、STRING软件、Cyto Scape软件对筛选出的差异表达的miRNA进行靶基因预测。并进行GO功能富集分析、KEGG富集通路分析、模式聚类分析。使用lipo6000转染试剂将差异表达的miRNA的mimics、NC和inhibitor、In C转染到HepG2细胞内,使用Trizol提取细胞内总RNA,以茎环法反转录miRNA成c DNA,m RNA反转录成c DNA,并采取实时荧光定量PCR技术（RT-q PCR）检测实验组和对照组的miRNA的m RNA水平和预测靶基因的m RNA水平。采取Western Blot技术检测实验组和对照组的靶蛋白的表达量变化。利用Target Scan、miRDB预测miRNA与靶基因的结合位点,并用双萤光素酶报告基因实验验证miRNA是否与预测位点结合。结果:（1）0.5 m M油酸（OA）诱导HepG2细胞24 h,细胞内TG含量显著上升（P＜0.01）,细胞毒性无显著差异（P＞0.05）,0.5μM的AWRK6处理高脂细胞模型24 h后,细胞内TG含量显著下降（P＜0.01）,细胞毒性无显著差异（P＞0.05）,说明该条件为AWRK6的最适作用条件。OA、AWRK6处理后细胞周期并未明显改变,NC+AWRK6组细胞的周期蛋白CCNB的m RNA水平和蛋白质表达水平相较于NC组显著降低（P＜0.05）,各组间的周期蛋白CCNA、CCND、CCNE的m RNA水平和蛋白质表达水平无显著变化;AWRK6对人肝细胞凋亡无影响。（2）Illumina高通量测序结果显示,MAFLD组相较于NC组共有18种差异表达的miRNA（P＜0.05）,其中有8种miRNA水平下调,10种miRNA水平上调;AWRK6组相较于MAFLD组共有7种差异表达的miRNA（P＜0.05）,其中有2种miRNA水平下调,5种miRNA水平上调。实时荧光定量PCR技术（RT-q PCR）检测显示,MAFLD组与NC组细胞相比,miRNA-5100和miR-505-3p水平上调,AWRK6组与MAFLD组细胞相比miR-5100和miR-505-3p水平下调。（3）生信预测分析表明,miR-505-3p的靶基因为HMGB1、PTEN、MAPK9、COL3A1、NUDT21、HNRNPM、SRSF11、DHX15、UPF3B;miR-5100的预测靶基因为TRAF6、G6PC、IL17A、SCD、NQO1、PLIN2、HMGCR、KLB、LOX、PPP1R3B、CYP7B1、HADH、MEFV、ATP8A1、PGRMC1、CEACAM3、MOSPD2、ITGAV、RAP1A、RAP2B、TLN1、FAM131B、IQGAP1、QKI、FAM114A2、SRSF1、SYF2、U2SURP、PRPF40A、LUC7L2、SNRPD3、CWC27、CPSF2。其中,经过转染和实时荧光定量PCR技术（RT-q PCR）验证得到miR-5100的靶基因为G6PC（葡萄糖-6磷酸酶催化亚基）。GO功能富集分析结果显示靶基因功能富集在细胞发育、细胞代谢过程上,KEGG富集通路分析结果表明靶基因作用于癌症中的转录失调（transcriptional misregulation in cancer）、细胞周期（cell cycle）、Fox O信号通路（Fox O signaling pathway）、粘合连接（Adherens junction）、转化生长因子-β信号通路（TGF-beta signaling pathway）。Western Blot结果显示,miR-5100降低了G6PC的蛋白表达。双萤光素酶报告基因系统检测miR-5100与G6PC靶向结合结论:AWRK6缓解油酸诱导的肝细胞脂质累积,高表达的miR-5100和miR-505-3p在AWRK6处理后下调,而G6PC是miR-5100的靶基因。这些结果提示miRNA参与调控AWRK6缓解肝细胞脂质累积,其中miR-5100通过靶向G6PC起作用。