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为了研究低温胁迫对中华鳖(Pelodiscus sinensis)早期炎性因子IL6肠道表达的影响,本论文首先细致划分了中华鳖的肠道。采用形态学观察、组织切片的方式研究了中华鳖的九段肠道。使用已经在哺乳动物和鱼类的肠道中报道的9个基因,从功能上区分中华鳖肠道各区段。其次,为研究肠道部分的免疫功能,聚焦于免疫因子il6,在克隆了中华鳖il6的cDNA全长后,从启动子、基因结构、共线性关系、相似性分析、系统发育和蛋白结构等方面对其进行生物信息学分析;采用qPCR手段进行了组织表达模式分析。最后,为了探究il6免疫功能,利用免疫刺激剂(LPS、Con A和PolyI:C)在体外刺激脾脏原代细胞的实验;为了探究低温胁迫对il6的影响,我们采用两个温度(25°C,15°C)、两种细菌(革兰氏阴性与阳性菌)体内攻毒的方式从5个时间点(6h,12h,24h,72h和7d)来检测il6在肠道以及脾脏中的表达变化情况。实验结果如下:1.传统手段与分子生物学方法相结合对中华鳖肠道的划分根据标记分子在各区段的表达情况,对比形态学、组织学观察分析得到,从S1到S3(从肠道起始占总长度的29.9%的位置,29.9%)的区域相当于哺乳动物十二指肠,而S4(40.2%)到S5(65.4%)、S8(92.7%)与S9分别相当于哺乳动物回肠和大肠。而对于S6(81.3%)和S7(87.3%),其功能多样,并且取决于功能基因。它们可能是小肠和大肠之间的过渡区或者属于大肠部分。2.中华鳖il6的克隆及组织表达模式分析启动子分析显示,il6的启动子含有保守的转录因子结合位点。il6 cDNA全长为2069bp,开放阅读框长度为663bp,而il6ns cDNA全长为2194bp,开放阅读框长度为615bp,两者差异仅限于信号肽位置(il6编码信号肽的序列中插入了一段125bp的序列导致il6ns不编码信号肽)。中华鳖il6与鸟类、哺乳类相比均有保守的共线性关系,且相似性一致性较高。中华鳖il6与哺乳类、鱼类的基因结构类似,而中华鳖il6ns与鸟类的基因结构相似。蛋白二级结构主要包括α-螺旋、延伸链、无规则卷曲、β-转角。三级结构包含IL-6/G-CSF/MGF家族特征序列(C–X(9)–C–X(6)–G–L–X(2)–Y–X(3)–L),序列末端还具有aataaa加尾信号等。系统进化分析显示,与鸟类首先聚类,其次是哺乳类,最后是鱼类。同时,以人IL6蛋白为模型构建了中华鳖IL6蛋白的3D结构模型。组织表达模式分析结果则显示,两个il6在体内的分布差异较大。3.低温胁迫对中华鳖肠道免疫因子il6 mRNA表达的影响il6/il6ns两个转录本在金黄色葡萄球菌或嗜水气单胞菌胁迫后,表达量随时间推移整体均呈现先升后降的趋势,且il6的表达受低温胁迫的影响表现出“应答延迟”和“表达增强”的现象。此外还发现,在受到细菌入侵后,il6的mRNA表达量对细菌的应答反应要强于il6ns的。体外实验表明,脾脏细胞在PolyI:C的刺激下6h il6/il6ns表达极显著上调(P<0.01),在24h和48h表达量迅速回落。但是,在Con A和LPS的刺激下,两个基因在各个时刻均没有显著性变化。综合以上研究结果得出如下结论:1.通过检测中华鳖中一些与哺乳类以及斑马鱼同源的标记分子,可以得到一个与传统形态学及组织学不同的、更为精确的中华鳖肠道划分结果。2.克隆得到了两个中华鳖的il6的cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析。弥补了爬行类il6研究的空白,证实了两个基因在组织内的分布情况不同。3.低温胁迫会对中华鳖il6应对细菌的免疫应答造成影响。且发现il6的两个转录本在胁迫后的表达模式不同。提示它们在体内有不同的功能。