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目的:分别通过鱼油、eIF2а去磷酸化抑制剂salubrinal干预,采用配方奶喂养+缺氧+冷刺激+LPS灌胃多因素联合构建坏死性小肠结肠炎(NEC)新生大鼠模型,动态研究新生大鼠NEC发病过程中肠道组织内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)中PERK/eIF2а/CHOP信号通路中相关分子PERK、p-PERK、eIF2а、p-eIF2а、CHOP的表达,进一步深入探讨ERS信号通路在NEC发病机制中的作用,并试图揭示鱼油对新生大鼠NEC肠道保护作用的可能分子机制,为临床防治NEC提供新思路和实验依据。材料与方法:240只母乳喂养1日龄清洁级Sprague-Dawley(SD)新生大鼠,体质量5-10 g,雌雄不限,母乳喂养至7日龄,体质量13-18 g,随机分为六组:NEC组(NEC组,n=40)、鱼油干预组(FO组,n=40)、Salubrinal干预组(SAL组,n=40)、Salubrinal+鱼油联合干预组(SF组,n=40)、对照组(CON1组,n=40)和二甲基亚砜对照组(CON2组,n=40)。NEC组:于生后第8天开始每天采用配方奶喂养+缺氧+冷刺激+LPS灌胃多因素联合方法连续3天构建NEC模型,造模同时每日予生理盐水(NS)(0.6ml/100g.d)灌胃、腹腔内注射NS(1ml/100g.d)各一次;FO组:于生后第8天开始连续3天建立NEC模型(方法同上),造模同时每日予鱼油(浓度为35%,剂量为0.6ml/100g.d)灌胃、腹腔内注射等量NS各一次;SAL组:于生后第8天开始连续3天建立NEC模型(方法同上),造模同时每日等量NS灌胃、Salubrinal(1 mg/kg)腹腔注射各一次;SF组:于生后第8天开始连续3天建立NEC模型(方法同上),造模同时每日鱼油(浓度为35%,剂量为0.6ml/100g.d)灌胃、Salubrinal(1 mg/kg)腹腔注射各一次;CON1组:7日龄新生SD大鼠继续母乳喂养,并于生后第8天开始连续3天每日予等量NS灌胃、腹腔内注射等量ns各一次;con2组:7日龄新生sd大鼠继续母乳喂养,并于生后第8天开始连续3天每日予等量ns灌胃、腹腔内注射1%dmso(1ml/100g.d)各一次。观察六组新生大鼠造模0小时、12小时、24小时、48小时、72小时五个时间点一般情况及72小时nec发病率;并分别于造模过程中各时间点随机取8只处死,留取十二指肠下端至直肠上端肠道组织,观察肠道大体形态改变,取回盲部近端肠道组织he染色病理组织学检查结合肠道组织损伤病理评分评估肠道损伤程度,采用western-blot技术检测perk、p-perk、eif2а、p-eif2а、chop蛋白表达水平,并采用rt-pcr技术检测chop基因表达水平。结果:1、六组新生大鼠外观表现及一般情况:实验过程中,con1组和con2组新生大鼠活动度良好,体重增长良好,皮下脂肪丰满,无腹胀,大便次数及性状正常;自造模刺激开始后nec组大鼠相继出现活动度下降,反应迟钝,倦怠,呼吸增快,体重增长缓慢,皮下脂肪减少,皮肤松弛,腹胀,不同程度地解黄绿色粘液稀便,大便次数增多,随造模时间延长上述表现渐加重;sal组、sf组和fo组大鼠表现介于两者之间,活动度尚可,大便次数稍增多,性状尚可。2、六组新生大鼠肠道大体形态、病理观察及肠道损伤病理评分比较:con1组、con2组两组新生大鼠肠道呈淡黄色,肠壁光滑完整,弹性可,无肠道发黑、肠腔扩张等;nec组新生大鼠肠道呈暗紫色或黑色,肠腔扩张,肠壁变薄,局部有血栓形成;sal组、sf组、fo组三组肠道稍发黑、扩张,少数有积气;sf组、fo组两组肠道大体形态较sal组稍改善。he染色后光镜下观察见con1组、con2组两组各时间点肠粘膜绒毛完整,结构正常;nec组从12小时开始出现轻度粘膜下和/或固有层肿胀分离,渐进展为72小时局部肠绒毛脱落伴坏死,中重度粘膜层、固有层分离,炎性细胞浸润等改变;sal组、sf组、fo组三组从24小时开始出现轻度粘膜下和/或固有层肿胀分离,渐进展为72小时时局部肠绒毛脱离,轻中度粘膜层、固有层分离,炎症细胞浸润等改变;与con1组、con2组比较,nec组肠道损伤病理评分在12、24、48、72小时均显著升高(均p<0.05),sal组、sf组、fo组三组病理评分在24、48、72小时均显著升高(均p<0.05);与nec组相比,sal组、sf组、fo组三组病理评分在12、24、48、72小时均显著降低(均p<0.05)。3、六组新生大鼠72小时nec发病率比较:con1组和con2组新生大鼠无一例发生nec;nec组有7只发生nec,其发病率为87.5%;sal组有4只发生nec,其发病率为50%;sf组有3只发生nec,其发病率为37.5%;fo组有3只发生nec,其发病率为37.5%。与con1组、con2组相比,nec组、sal组、sf组和fo组四组nec发病率均显著升高(均p<0.01);与nec组相比,sal组、sf组和fo组三组nec发病率均显著降低(均p<0.01)。4、六组新生大鼠肠道组织中perk、p-perk、eif2а、p-eif2а、chop蛋白动态表达水平比较4.1、六组新生大鼠肠道组织中perk、p-perk蛋白动态表达水平比较:con1组、con2组、nec组、sal组、sf组和fo组六组组间及组内不同时间点perk蛋白的表达均无明显差异(均p>0.05);con1组、con2组两对照组组内不同时间点p-perk蛋白的表达均无显著差异(均p>0.05);nec组、sal组p-perk蛋白表达在12小时开始升高,且随造模时间延长呈递增趋势,于72小时达峰;sf组、fo组p-perk蛋白表达在12小时开始升高,24小时达到高峰后呈下降趋势;与对照组相比,nec组、sal组、sf组、fo组四组p-perk蛋白表达在12、24、48、72小时四个时间点均增高(均p<0.05);与nec组相比,sal组p-perk蛋白表达在12、24、48、72小时四个时间点均无明显差异(均p>0.05),sf组、fo组两组p-perk蛋白表达在12、24、48、72小时四个时间点均降低(均p<0.05);与sal组相比,sf组、fo组两组p-perk蛋白表达在12、24、48、72小时四个时间点均降低(均p<0.05);sf组、fo组两组p-perk蛋白表达相比在12、24、48、72小时四个时间点均无明显差异(均p>0.05)。4.2、六组新生大鼠肠道组织中eif2а、p-eif2а蛋白动态表达水平比较:con1组、con2组、nec组、sal组、sf组和fo组六组组间及组内不同时间点eif2а蛋白表达均无显著差异(均p>0.05);两对照组组内不同时间点p-eif2а蛋白表达均无统计学意义(均p>0.05);nec组、sal组、sf组和fo组四组p-eif2а蛋白表达在12小时开始升高,且随造模时间延长呈递增趋势,于72小时达峰;与对照组相比,nec组、sal组、sf组和fo组四组p-eif2а蛋白表达在12、24、48、72小时四个时间点均增高(均p<0.05);与nec组比较,sal组p-eif2а蛋白表达在0、12小时无显著差异(p>0.05),而在24、48、72小时明显增高(均p<0.05),sf组、fo组两组p-eif2а蛋白表达在12、24、48、72小时四个时间点均降低(均p<0.05);与sal组相比,sf组、fo组两组p-eif2а蛋白表达在12、24、48、72小时四个时间点均降低(均p<0.05);sf组、fo组两组p-eif2а蛋白表达相比在12、24、48、72小时四个时间点均无明显差异(均p>0.05)。4.3、六组新生大鼠肠道组织中chop蛋白动态表达水平比较:con1组、con2组两对照组组内不同时间点chop蛋白的表达均无明显差异(均p>0.05);nec组chop蛋白表达在12小时即明显升高,且随造模时间延长呈递增趋势,于72小时达峰;sal组chop蛋白表达在24小时即明显升高,且呈递增趋势,于72小时达峰;sf组、fo组chop蛋白表达在24小时稍升高,与12小时比较差异无统计学意义(p>0.05),自48小时起chop蛋白表达明显升高,于72小时达峰;与对照组比较,nec组chop蛋白表达在12、24、48、72小时均增高(均p<0.05),sal组chop蛋白表达在24、48、72小时增高(均p<0.05),sf组、fo组两组chop蛋白表达在48、72小时表达增高(均p<0.05);与nec组相比,sal组、sf组和fo组三组chop蛋白表达在12、24、48、72小时均降低(均p<0.05);与sal组相比,sf组、fo组两组chop蛋白表达在24、48、72小时三个时间点均降低(均p<0.05);sf组、fo组两组chop蛋白表达相比在12、24、48、72小时四个时间点均无明显差异(均p>0.05)。5、六组新生大鼠肠道组织中chopmrna基因动态表达水平比较:con1组、con2组两对照组组内不同时间点chopmrna的表达均无明显差异(均p>0.05);nec组chopmrna表达在12小时开始明显升高,且随造模时间延长呈递增趋势,于72小时达峰;sal组chopmrna表达在12小时即明显升高,且随造模时间延长表达逐渐增高,于72小时达峰;sf组、fo组chopmrna表达在12小时稍增高,自24小时起chopmrna表达明显升高,于72小时达峰。组间比较:与对照组相比,nec组、sal组两组chopmrna表达在12、24、48、72小时均增高(均p<0.05),而sf组、fo组两组chopmrna表达则在24、48、72小时增高(均p<0.05);与nec组相比,sal组、sf组和fo组三组chopmrna表达在12、24、48、72小时均降低(均p<0.05);与sal组相比,sf组chopmrna表达在24、48、72小时三个时间点均降低(均p<0.05);fo组chopmrna表达在24、72小时两个时间点均降低(均p<0.05);sf组、fo组两组chopmrna表达相比在12、24、48、72小时四个时间点均无明显差异(均p>0.05)。结论:1、配方奶喂养+缺氧+冷刺激+LPS灌胃等多种致病危险因素可成功构建NEC模型。2、肠道组织ERS的PERK/eIF2а/CHOP信号通路相关分子p-PERK、p-eIF2а、CHOP蛋白及CHOPmRNA基因的表达在NEC模型组中均升高,且随造模刺激时间延长呈进行性升高;而SAL组中p-eIF2а蛋白表达升高、CHOP蛋白及CHOPmRNA的表达降低,NEC大鼠肠道损伤改善,提示PERK/eIF2а/CHOP信号通路参与新生大鼠NEC的发生、发展,而salubrinal可能通过抑制ERS信号通路中p-eIF2а去磷酸化、抑制CHOP基因及蛋白的表达而起作用。3、鱼油能降低NEC大鼠肠道组织中p-PERK、p-eIF2а、CHOP蛋白及CHOPmRNA基因的表达,减轻NEC大鼠肠道损伤的程度,提示其保护作用可能与抑制PERK/eIF2а/CHOP信号通路有关。