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背景:骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一类以软骨炎症反应引起软骨细胞凋亡和软骨细胞外基质降解为主要表现的关节软骨退行性病变,严重影响了患者的生活质量和社会功能。人参皂甙Rg1(GinsenosideRg1,Rg1)是从人参中提取的药用成分。既往研究证实Rg1能够抑制神经系统中的炎症反应并降低神经细胞的凋亡,表明Rg1具有治疗骨关节炎的潜质。然而Rg1能否治疗骨关节炎目前还尚未有报道。本研究观察并探讨了 Rg1对骨关节炎的治疗作用。共分三部分:第一部分:人参皂甙Rg1对大鼠骨关节炎的治疗作用目的:观察人参皂甙Rg1对大鼠OA的治疗作用。方法:本实验分别使用前交叉韧带切除法(Anterior cruciate ligament transaction,ACLT)和碘乙酸(Monoiodoacetic acid,MIA)膝关节腔注射法两种方法建立大鼠骨关节炎模型。两种OA造模方法分别取48只Sprague Dawley(SD)大鼠,随机分为四组,每组12只大鼠。共计96例右膝关节。实验分组分别为①空白对照组:大鼠不给予处理措施;②OA造模组:大鼠给予ACLT或MIA膝关节腔注射进行OA造模;③Rg1治疗组1:给予OA造模后口服30 mg/kg Rg1进行治疗;④Rg1治疗组2:给予OA造模后口服60 mg/kg Rg1进行治疗。ACLT造模大鼠于12周后处死,MIA造模大鼠于8周后处死。解剖显微镜大体观察标本病变情况。常规制备关节软骨病理切片,苏木素-伊红、番红-固绿和甲苯胺蓝染色对关节软骨进行病理学观察。通过免疫组化染色观察关节软骨中Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)-13和前列腺素2(Prostaglandin 2,PGE2)的变化。使用承重实验、机械痛阈检测和热痛阈检测观察大鼠OA的疼痛反应。结果:大体观察结果表明Rg1能够明显改善了 OA大鼠关节软骨的破坏。病理切片显示,通过Rg1的治疗关节软骨中软骨细胞数量、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的含量均较OA造模组明显增高,软骨结构较清晰、完整。免疫组化结果表明Rg1明显抑制了软骨细胞中MMP-13和PGE2的合成。此外,Rg1还能够有效缓解MIA引起的OA疼痛反应,降低OA疼痛的敏感度。结论:Rg1能够抑制关节软骨的炎症反应,减少关节软骨的损伤,对OA具有一定的治疗作用。第二部分:人参皂甙Rg1对大鼠软骨细胞凋亡的作用及相关机制研究目的:探讨人参皂甙Rg1对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡的作用及相关机制。方法:取1周龄的SD大鼠关节软骨进行体外培养。分别使用10 μg/mL的Rg1或10 μg/mL Rg1+25 μmol/mL LY294002处理软骨细胞2小时后再加入10 ng/ml的IL-1β或单独使用IL-1β培养软骨细胞。空白对照组不做任何处理。72小时后使用MTT法检测细胞活性。96小时后使用TUNEL法和Annexin V/propidium iodide染色流式细胞法检测细胞凋亡。24小时后使用Western Blot法检测蛋白激酶B(ProteinkinaseB,Akt)、p-Akt、B淋巴细胞瘤基因-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2 相关 X 蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)、细胞色素C(Cytochrome C,CytC)、MMP-13和基质金属蛋白酶组织抑制剂(Tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP-1)的含量变化。24小时后定量比色法检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Cysteine-containing aspartate-specific proteases,Caspase-3)的活性。结果:我们的实验结果显示预先给予Rg1保护软骨细胞能够明显抑制IL-1β诱导的软骨细胞毒性作用,减少软骨细胞的凋亡。与IL-1β组相比,给予Rg1保护软骨细胞能够明显降低IL-1β对Akt磷酸化激活的抑制作用。在Rg1的保护作用下,Bcl-2/Bax的比值较IL-1β组明显增高,线粒体释放Cyt C的含量明显降低,Caspase-3的激活也受到明显抑制。此外Rg1还能通过PI3K/Akt信号通路促进TIMP-1的表达从而降低MMP-13的活性。结论:Rg1能够抑制软骨细胞凋亡,其机制可能与Akt-线粒体-Caspase-3信号通路有关。第三部分:NF-κB信号通路在人参皂甙Rg1治疗骨关节炎中的作用目的:探讨核因子活化B细胞κ轻链增强子(Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)信号通路在人参皂甙 Rg1治疗骨关节炎中的作用。方法:取1周龄的Sprague Dawley大鼠关节软骨进行体外培养。给予10μg/mL Rg1 和 10 ng/mL IL-1β 共同培养 0、24、48 小时后使用 Western Blot 法检测Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的含量变化。给予10μg/mLRg1和10ng/mLIL-1β共同培 0、15、30、45 分钟后 Western Blot 法检测 p-NF-κB p65、NF-κB 抑制物(Inhibitor ofNF-κBα,IκBα)、p-IκBα 的含量变化。结果:Rg1能够明显降低IL-1β对Ⅱ型胶原和蛋白聚糖合成的抑制作用。给予Rg1能够明显减少IL-1β诱导的NF-κB p65的磷酸化激活及核转移。Rg1同样能够抑制IL-1β诱导的IκBα的磷酸化激活,并且给予蛋白酶抑制剂ALLN不能影响Rg1对IκBα激活的抑制作用。结论:Rg1能够抑制IκB-NF-κB信号通路的激活,降低软骨细胞外基质的降解。