【摘 要】
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芽孢杆菌是食品工业中的重要腐败细菌,不仅能产生抗逆性极强的芽孢,同时可在加工设备表面形成难以彻底清除的生物被膜,导致产品微生物反复污染,给食品安全与品质带来严重的影响。食品工业中芽孢杆菌及其生物被膜的污染控制极具挑战性。本研究考察藤椒精油对1株豆制品腐败解淀粉芽孢杆菌菌株DY1a的抑菌和抗生物被膜作用,并采用微观形态观察,代谢活性分析结合转录组测序和反向分子对接技术解析藤椒精油的抗菌和抗生物膜的分
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芽孢杆菌是食品工业中的重要腐败细菌,不仅能产生抗逆性极强的芽孢,同时可在加工设备表面形成难以彻底清除的生物被膜,导致产品微生物反复污染,给食品安全与品质带来严重的影响。食品工业中芽孢杆菌及其生物被膜的污染控制极具挑战性。本研究考察藤椒精油对1株豆制品腐败解淀粉芽孢杆菌菌株DY1a的抑菌和抗生物被膜作用,并采用微观形态观察,代谢活性分析结合转录组测序和反向分子对接技术解析藤椒精油的抗菌和抗生物膜的分子作用机理。主要研究结果如下:1.藤椒精油主要成分分析及其对解淀粉芽孢杆菌的抗菌效果评价。气相色谱-质谱分析结果表明,藤椒精油主要成分有芳樟醇（52.37%）、D-柠檬烯（21.81%）等。藤椒精油对解淀粉芽孢杆菌的最小抑菌浓度为3.2μL/m L,最小杀菌浓度为12.8μL/m L,并在1 MIC浓度下抑制腐败菌胞外蛋白酶的产生。2.藤椒精油对解淀粉芽孢杆菌DY1a的抗菌作用机理分析。扫描电镜与透射电镜观察结果表明,藤椒精油处理可破坏解淀粉芽孢杆菌菌体细胞壁完整性,菌体表面出现膨胀、坍缩和孔洞,胞内内容物大量外泄。进一步分析表明,精油处理使细菌胞外溶液的电导率、β-半乳糖苷酶活性和碱性磷酸酶活性上升,核酸和蛋白质等胞内分子泄漏,细菌细胞壁和细胞膜通透性增强。并显著降低胞内三羧酸循环中的胞浆异柠檬酸脱氢酶与琥珀酸脱氢酶活性。因此,藤椒精油可通过破坏细胞壁、细胞膜的完整性,影响细胞呼吸代谢关键酶活性而发挥抗菌作用。3.藤椒精油对解淀粉芽孢杆菌DY1a生物被膜的抑制作用。亚抑制浓度藤椒精油（1/2 MIC、1/4 MIC）可延迟腐败菌生物被膜的形成,1 MIC藤椒精油能完全抑制生物被膜的形成。不同浓度藤椒精油处理成熟生物被膜发现,精油能显著降低生物被膜的代谢活性,1 MIC浓度精油处理24 h后,成熟生物被膜中活菌数由9.73lg（CFU/cm~2）降低至8.48 lg（CFU/cm~2）。此外,藤椒精油可显著抑制细菌菌体的泳动与丛集运动,降低菌体的黏附能力,改变细胞表面疏水性和电位,并在亚抑菌浓度下抑制生物被膜基质多糖及蛋白质的合成,降低生物被膜表面粗糙度和形成量。4.基于转录组基因测序和生物信息学分析,再结合反向分子对接技术的藤椒精油对解淀粉芽孢杆菌DY1a的抗生物被膜分子机理解析。转录组测序分析结果显示,1/4 MIC浓度的藤椒精油胁迫培养20 h后,菌体差异表达基因有1092个,其中上调基因518个,下调基因574个。GO和KEEG分析结果表明,1/4 MIC藤椒精油胁迫培养可显著下调鞭毛组装相关基因（flh A、flg M等）,趋化运动相关基因（mot A、che W等）,群体感应相关基因（lux S）,双组分系统相关基因（deg S、deg U等）,生物被膜基质多糖合成相关基因（eps A、tas A）和基质疏水蛋白Bsl A的编码基因bsl A等关键基因表达水平,最终干扰腐败菌生物被膜的形成和结构。采用反向钓靶筛选获得藤椒精油主要活性成分芳樟醇的主要抗菌靶蛋白,并通过分子对接发现,芳樟醇可通过分子间的氢键作用、疏水作用以及范德华力等作用力与细菌群体感应信号AI-2生物合成过程中的S-核糖基高半胱氨酸酶Lux S、细胞分裂温度敏感突变体Fts Z、对蛋白折叠起关键作用的分子伴侣Gro ES以及细胞壁肽聚糖合成关键酶Mur G相结合,改变酶蛋白分子构象,影响酶功能活性,并最终导致菌体分裂异常,干扰群体感应系统关键信号分子合成,影响生物被膜的形成。
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