防己黄芪汤调控淋巴回流功能治疗膝骨关节炎的机制研究

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目的:膝骨关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一种慢性退行性关节疾病,以关节软骨破裂、软骨下骨重塑和滑膜炎症为特征。在我国,KOA的患病率高,危害性大,目前仍缺乏有效治疗药物。在本研究中,我们研究防己黄芪汤是否通过调节淋巴引流功能改善KOA小鼠关节结构或延缓KOA小鼠膝关节退变过程。方法:1、早期膝骨关节炎与淋巴回流功能相关性研究10周龄雄性C57BL/6小鼠右膝关节DMM手术造模,左膝对照,分别在术后1周、2周、3周、4周、5周时检测取材。我们通过淋巴回流功能检测、ABOG染色、免疫荧光染色,分析膝骨关节炎与淋巴回流功能之间的相关性。2、防己黄芪汤调控淋巴回流功能治疗膝骨关节炎的体内实验研究10周龄雄性C57BL/6小鼠右膝关节注射VII型胶原酶诱导KOA模型,左膝注射PBS作为对照组。将小鼠随机分为三组,KOA模型组给予PBS溶液;防己黄芪汤组给予中药复方防己黄芪汤;莫比可组给予莫比可片,每只小鼠隔日灌胃0.2ml溶液。分别在造模后4周、6周、8周、10周时取材,每组10只。采用吲哚菁绿近红外(ICG-NIR)淋巴成像系统检测关节淋巴回流功能;ABOG染色法进行组织形态学染色,检测关节结构变化与关节软骨面积;采用OARSI score评分来评估关节退变程度;免疫组化染色检测膝关节二型胶原和Nitege表达,评估膝关节关节软骨退变程度;免疫荧光双染色技术检测膝关节周围成熟淋巴管、毛细淋巴管以及血管分布。3、防己黄芪汤冻干粉对淋巴管平滑肌细胞的作用研究建立原代肠系膜淋巴管平滑肌细胞培养体系,制作了防己黄芪汤冻干粉,使用一氧化氮供体药物(DETA NONoate)处理原代淋巴管平滑肌细胞,用防己黄芪汤干预,检测淋巴管平滑肌细胞功能基因表达。结果:1、早期膝骨关节炎发展与淋巴回流功能变化相关性研究通过对术后1-5周膝关节淋巴回流功能检测,证明早期KOA淋巴回流功能显著低于正常组。ABOG染色的分析显示早期KOA关节破坏逐渐加重,免疫荧光淋巴管染色显示淋巴管随着KOA的变化逐渐增多。淋巴回流功能与KOA的进展相关。2、防己黄芪汤改善了淋巴回流功能,延缓膝骨关节炎进展PBS组淋巴回流功能较假手术组明显降低。防己黄芪汤治疗后4周和6周淋巴引流功能改善。统计分析结果表明,膝关节淋巴回流功能(ICG清除率)与组织损伤程度(OARSI score评分)之间存在较强的相关性。ABOG染色显示防己黄芪汤组软骨损伤较少,OARSI评分较低。免疫组化染色(IHC)结果显示,防己黄芪汤在4周和6周时均能提高OA小鼠膝关节II型胶原的含量。石蜡切片免疫荧光双染色表明,防己黄芪汤组毛细血管和成熟淋巴管在4周时增加。3、防己黄芪汤促进淋巴管平滑肌收缩功能基因表达在一氧化氮供体药物干预下,淋巴管平滑肌细胞通过防己黄芪汤预处理,收缩功能相关基因表达增加。结论:早期KOA模型淋巴回流功能与对照组相比显著下降。防己黄芪汤能够改善早期KOA淋巴回流功能,促进早期KOA毛细淋巴管和成熟淋巴管增多。防己黄芪汤能延缓II型胶原含量的丢失,延缓早期KOA退变进程。防己黄芪汤能够促进淋巴管平滑肌细胞收缩功能基因表达。
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