甘蔗(Saccharum officenarum L.)是中国乃至世界第一大糖料作物,也是重要的能源作物。甘蔗是喜温作物,广泛种植于热带和亚热带地区,需要适宜的温度和湿度才能正常生长。近年来,世界气候变化异常,极端低温频发,寒害、冻害增多,给甘蔗生产造成巨大的损失。因此,开展甘蔗抗寒机制的研究具有重要的意义。目前,国内外对甘蔗低温胁迫下根系的形态、解剖、生理生化代谢和分子水平等方面研究的综合报道较少,本研究对甘蔗幼苗进行低温胁迫处理,从根系形态、细胞亚显微结构、生理生化代谢水平与常温下生长的甘蔗进行比较分析,以期探讨低温胁迫下甘蔗根系的生长、生理生化特性以及相关基因等指标与抗寒性的关系；并对甘蔗微管蛋白α-tubulin基因进行克隆和表达分析,同时对该蛋白进行原核表达、纯化并制备单克隆抗体；利用农杆菌介导法在烟草和甘蔗上进行遗传转化,初步验证α-tubulin基因在植物耐寒性等的功能。主要的研究内容与结果如下：1.低温抑制了根系的生长。与正常条件生长的对照根系相比,低温胁迫下的根系表现根尖发黄,褐化,坏死；根长和根体积的增加量均显著低于对照；两个甘蔗品种(ROC22和GT28)的生物量均比对照明显降低,但根冠比差异不显著；两个品种相比较,发现ROC22地上部和地下部受低温影响显著高于GT28；超微结构观察结果显示：低温胁迫导致根尖细胞由方变圆,结构紊乱,细胞器减少,细胞膜破坏,细胞核解体,线粒体内嵴模糊,逐渐成为空泡状,部分溶解,ROC22细胞和细胞器受伤害程度大于GT28。2.低温明显影响甘蔗根系蛋白质、糖含量以及蛋白酶活性。在低温胁迫下,ROC22可溶性蛋白质先略微上升后下降,GT28可溶性蛋白质先升高后下降再升高,且保持在较高水平；ROC22氨基酸含量表现为先升高后降低,在第5和9 d显著低于对照,而GT28的氨基酸含量则始终高于对照。ROC22的可溶性糖和非可溶性糖含量逐渐下降,与对照差异显著,而GT28中可溶性糖逐渐上升,并高于对照组,但非可溶性糖含量则先上升后下降。根系中肽链内切酶活性先升高后下降,在弱酸性条件活性高于碱性条件下,并且GT28活性普遍高于ROC22；羧肽酶和氨肽酶在短时间低温下变化不显著,但在第9 d时ROC22羧肽酶活性激增,氨肽酶活性速降,GT28中这两个酶活性变化不显著。3.成功构建pET30a(+)-α-tubulin原核表达载体,利用IPTG诱导产生融合蛋白,原核表达结果显示重组的pET30a(+)-α-tubulin为49.6kDa。重组蛋白通过Ni2+-NTA柱亲和层析纯化和透析浓缩后制备单克隆抗体,用ELISA法检测α-tubulin单克隆的效价,结果表明本研究所制备的α-tubulin单克隆抗体的效价高于1：512000。用Western Blot检测甘蔗α-微管蛋白获得了特异性的条带,说明甘蔗α-微管蛋白单克隆抗体已被成功制备。4.利用qRT-PCR技术分析了α-tubulin基因在甘蔗中转录水平的表达,结果表明α-tubulin基因在甘蔗茎中的表达量最高,根中次之,叶中最少。低温胁迫下,α-tubulin基因在根、茎和叶中的表达量是先升高后降低,最后差异逐渐减小。利用Western Blot方法检测α-tubulin基因在甘蔗中蛋白质水平的表达,发现ROC22根中α-微管蛋白表达逐渐下降,而GT28中α-微管蛋白先升高后下降,但都高于对照。5.成功构建了烟草表达载体pBI121-α-tubulin和甘蔗表达载体pCAMBIA3300-α-tubulin。将分别受CaMV35S和Ubi启动子控制的pBI121-α-tubulin和pCAMBIA3300-α-tubulin通过运用农杆菌介导法转入野生型烟草植株K346和甘蔗品种ROC22,经PCR检测和GFP观察以及Bar基因检测确证获得转基因烟草和甘蔗。6.对转α-tubulin基因烟草进行低温胁迫的功能验证。野生型和转基因烟草分别进行28℃(常温)和0-4℃(低温)处理,结果表明：低温胁迫对野生型和转基因型烟草叶绿素含量影响不显著。常温下,转基因烟草净光合作用显著高于野生型烟草,Pn、Gs、Tr显著高于野生型,而Ci显著低于野生型烟草。低温胁迫下,野生型和转基因烟草的光合作用受到抑制,并且都以呼吸作用为主,由强变弱后稳定。低温下,渗透物质可溶性蛋白质、可溶性糖和脯氨酸含量在转基因烟草中比野生型烟草中稳定。保护酶系统SOD和POD活性先升高后下降,但野生型烟草变化幅度显著高于转基因烟草；野生型烟草CAT活性逐渐下降,而转基因烟草CAT活性先下降后激增。说明α-tubulin的过量表达影响植物体内生理生化特性。7.利用qRT-PCR技术对转甘蔗α-tubulin基因的烟草进行表达分析,发现α-tubulin基因在两种基因型烟草叶脉中表达最高,茎中次之,叶中最低；转基因烟草叶和茎中α-tubulin基因表达显著高于野生型烟草,而叶脉中α-tubulin基因表达低于野生型烟草。低温胁迫下,野生型烟草叶片中α-tubulin基因表达逐渐降低,而转基因烟草叶片中α-tubulin基因表达有升有降,但显著高于野生型烟草。Western Blot检测α-tubulin蛋白质的表达,发现低温胁迫下,野生型烟草的α-tubulin蛋白质表达先升高后下降；而转基因型烟草中α-tubulin蛋白质表达先降低后升高然后降低再升高。以上结果表明,α-tubulin基因的过量表达提高了转基因烟草的耐低温性。