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目的:建立同时测定牛膝茎叶多指标成分的定量方法;通过比较不同采收期牛膝茎叶中指标成分和总甾酮、总皂苷、总多糖含量,确定牛膝茎叶的最佳采收期;研究不同采收期牛膝茎叶水提取物和乙醇提取物抗氧化活性与牛膝茎叶中总甾酮、总皂苷、总多糖含量的相关性;探究牛膝茎叶甾酮皂苷化学部位对H2O2诱导损伤的人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）的保护作用;从ACE-AngⅡ-AT1R轴和ACE2-Ang（1-7）-Mas轴研究牛膝和牛膝茎叶降压机制及对靶器官的保护作用。通过本实验研究,丰富牛膝茎叶的质量评价标准,为进一步开展牛膝茎叶的合理利用提供理论依据。方法:1.通过预实验确定牛膝茎叶含量测定的指标性成分为:芦丁、β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa;采用HPLC,CORTECSTM C18色谱柱（4.6 nm×50 mm,2.7μm）;流动相:乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）,梯度洗脱（0～4 min,13%A;4～4.5 min,13%A→14%A;4.5～8 min,14%A;8～9 min,14%A→30%A;9～15 min,30%A;15～15.5 min,30%A→32%A;15.5～17 min,32%A;17～18 min,32%A→13%A）;流速:1 m L/min;检测波长（0～4 min,257nm;4～9min,248nm;9～18min,203nm）;柱温:35℃;进样量:5μL,并进行方法学考察。2.以2020年9月中旬至2021年1月中旬采收的牛膝茎叶为研究对象,HPLC法测定其中芦丁、β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa的含量;紫外可见分光光度法测定不同采收期牛膝茎叶总甾酮、总皂苷和总多糖的含量。3.测定牛膝茎叶水提物和醇提物清除DPPH自由基、ABTS自由基的能力,对牛膝茎叶体外抗氧化活性进行初步评价,并采用皮尔逊双变量相关分析对不同采收期牛膝茎叶醇提物和水提物总甾酮、总皂苷、总多糖的成分含量和抗氧化活性进行相关性分析。4.本实验以H2O2诱导损伤HUVEC,建立氧化应激模型,各组药物与H2O2共培养后,检测上清液中乳酸脱氢酶（LDH）的活性和一氧化氮（NO）的含量,酶联免疫吸附（ELISA）法检测上清液中内皮素（ET-1）的浓度;Western Blot法检测相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的表达。5.（1）选用13周龄雄性WKY大鼠和SHR大鼠,适应性喂养大鼠后,进行单次给药时效关系和量效关系测定;（2）确定最佳给药时间和给药剂量后,将SHR大鼠随机分为模型组、氯沙坦组、牛膝甾酮皂苷高、低剂量组、牛膝茎叶甾酮皂苷高、低剂量组,每组10只,于每日上午灌胃一次,连续灌胃8周,并于每周一测定清醒状态下的各组大鼠心率（Heart rate,HR）、收缩压（Systolic blood pressure,SBP）、舒张压（Diastole blood pressure,DBP）和平均动脉压（Mean arterial pressure,MAP）;（3）ELISA法检测血清中血管紧张素原（Angiotensinogen,AGT）、醛固酮（Aldosterone,ALD）、血管紧张素转化酶（AngiotensinⅠconwerting enzyme,ACE）、血管紧张素转化酶2（AngiotensinⅠconwerting enzyme2,ACE2）、血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）、血管紧张素（1-7）（Angiotensin（1-7）,Ang（1-7））的水平;（4）Western blot法检测心脏和肾脏AT1R蛋白表达水平。结果:1.建立了HPLC同时测定牛膝茎叶中6种成分（芦丁、β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa）含量的方法,并进行了方法学考察进行验证,发现所建立的方法操作简单,重复性好。芦丁、β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa的线性范围分别为0.0344~0.6880μg（r=0.9993）、0.0426~0.8520μg（r=0.9989）、0.0159~0.3180μg（r=0.9988）、0.0300~0.6000μg（r=0.9989）、0.00706~1.4120μg（r=0.9988）、0.0676~1.352μg（r=0.9988）;加样回收率分别为104.44%、100.95%、95.78%、96.43%、102.00%、99.78%,RSD值分别为4.24%、1.09%、3.22%、1.52%、1.13%、2.19%。2.对同一产地、不同采收时间的牛膝茎叶样品指标成分含量测定结果进行分析,发现9月~10月采收时,各指标成分含量都较高;11月~12月采收时,除人参皂苷Ro外,其余各指标成分含量较之9月~10月采收均有所降低。对不同采收期牛膝茎叶醇提物和水提物中总甾酮、总皂苷和总多糖的含量进行分析,发现总甾酮和总皂苷的含量在10月中旬达到最大值,总多糖的含量在9月下旬达到最大值;总甾酮、总皂苷和总多糖的总量10月中旬含量最高,9月下旬次之。因此推测牛膝茎叶的最佳采集时间应为9月下旬至10月下旬,该时期指标成分和总甾酮、总皂苷、总多糖含量都较高。3.牛膝茎叶提取液相对其根部提取液具有较强的抗氧化能力,且牛膝茎叶水提取物抗氧化能力高于牛膝茎叶乙醇提取物抗氧化能力。牛膝茎叶中总甾酮含量和总皂苷含量与醇提物的抗氧化活性呈正相关,总多糖含量与水提物抗氧化活性相关呈正相关。总甾酮与总皂苷可能是牛膝茎叶乙醇提取物中具有抗氧化作用的成分,且对DPPH和ABTS自由基具有不同强度的作用;多糖则可能是牛膝水提物中具有抗氧化作用的成分。4.MTT实验筛选H2O2最佳损伤浓度为0.6 mmol/L。与空白组比较,模型组细胞培养上清液中LDH、ET-1含量显著升高（P＜0.01）,NO含量显著降低（P＜0.01）,表明H2O2氧化诱导损伤HUVEC模型造模成功;与模型组比较,各给药组LDH、ET-1含量降低,NO含量升高;表明牛膝甾酮皂苷和牛膝茎叶甾酮皂苷可以不同程度的保护H2O2损伤的HUVEC,提高损伤细胞的存活率。5.（1）进行单次给药时效关系和量效关系测定后,确定牛膝甾酮皂苷、牛膝茎叶甾酮皂苷高剂量组给药量为2.52 g/kg/d,低剂量组给药量为0.63 g/kg/d。氯沙坦组、牛膝甾酮皂苷高剂量组最佳给药时间为2 h;牛膝茎叶甾酮皂苷高剂量组最佳给药时间为0.5 h;牛膝甾酮皂苷低剂量、牛膝茎叶甾酮皂苷低剂量组最佳给药时间为1 h。（2）给药期间,与WKY组比较,各组SHR大鼠的SBP、DBP显著升高（P＜0.01）;与模型组比较,灌胃6周时,牛膝甾酮皂苷高剂量组HR、DBP显著降低（P＜0.05或0.01）,牛膝甾酮皂苷低剂量组HR显著降低（P＜0.01）,氯沙坦组DBP显著降低（P＜0.05）;灌胃7周时,牛膝甾酮皂苷低剂量组SBP、DBP、MBP显著降低（P＜0.01）,氯沙坦组DBP、MBP显著降低（P＜0.05）;灌胃8周时,牛膝甾酮皂苷高剂量组HR、SBP、DBP、MBP显著降低（P＜0.05或0.01）,牛膝茎叶甾酮皂苷高剂量组DBP显著降低（P＜0.05）,牛膝茎叶甾酮皂苷低剂量组HR、DBP显著降低（P＜0.05或0.01）。（3）从ACE-AngⅡ-AT1R轴研究牛膝茎叶甾酮皂苷部位降压的作用机制:与WKY组比较,模型组和各给药组的AGT降低,模型组、氯沙坦组、牛膝甾酮皂苷高剂量组ACE降低（P＞0.05）,模型组Ang II降低;模型组和各给药组的ALD显著升高（P＜0.05或P＜0.01）、REN升高（P＞0.05）,牛膝甾酮皂苷低剂量组、牛膝茎叶甾酮皂苷高、低剂量组ACE升高（P＞0.05）,牛膝茎叶甾酮皂苷低剂量组Ang II无明显变化,氯沙坦组、牛膝甾酮皂苷高、低剂量组、牛膝茎叶甾酮皂苷高剂量组Ang II升高（P＞0.05）;模型组大鼠心脏中的AT1R蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）,模型组大鼠肾脏中的AT1R蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较,牛膝甾酮皂苷高剂量组、牛膝茎叶甾酮皂苷高、低剂量组AGT升高（P＞0.05）,氯沙坦组ALD升高（P＞0.05）,氯沙坦组、牛膝甾酮皂苷高、低剂量组REN升高（P＞0.05）,各给药组ACE升高（P＞0.05）,各给药组Ang II升高（P＞0.05）;氯沙坦组、牛膝甾酮皂苷低剂量组AGT降低（P＞0.05）,牛膝甾酮皂苷高、低剂量组、牛膝茎叶甾酮皂苷高、低剂量组ALD降低（P＞0.05）,牛膝茎叶甾酮皂苷高、低剂量组REN降低。各给药组大鼠心脏中AT1R蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。牛膝茎叶甾酮皂苷低剂量组大鼠肾脏中AT1R蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）,牛膝甾酮皂苷高剂量组大鼠肾脏中AT1R蛋白表达水平有所升高（P＞0.05）,氯沙坦组、牛膝甾酮皂苷低剂量组、牛膝茎叶甾酮皂苷高剂量组大鼠肾脏中的AT1R蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。从ACE-AngⅡ-AT1R轴机制研究牛膝茎叶甾酮皂苷部位降压的作用机制:与WKY组比较,模型组AGT、ALD、ACE、Ang II含量显著升高（P＜0.05或P＜0.01）;与模型组比较,氯沙坦组、牛膝甾酮皂苷高剂量AGT含量显著降低（P＜0.01）,牛膝甾酮皂苷高、低剂量组ALD含量显著降低（P＜0.01）,牛膝甾酮皂苷低剂量、牛膝茎叶甾酮皂苷高、低剂量组AGT显著降低（P＜0.05）,氯沙坦组、牛膝茎叶甾酮皂苷高、低剂量组ALD含量显著降低（P＜0.05）,氯沙坦组、牛膝甾酮皂苷高剂量组、牛膝茎叶甾酮皂苷高、低剂量组ACE含量显著降低（P＜0.05）,氯沙坦组、牛膝甾酮皂苷高剂量组、牛膝茎叶甾酮皂苷高、低剂量组Ang II含量显著降低（P＜0.05）。牛膝甾酮皂苷组比较于牛膝茎叶甾酮皂苷组,有更显著的降低AGT、ALD含量的效果。（4）与WKY组比较,模型组大鼠心脏、肾脏中的AT1R蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较,氯沙坦组、牛膝甾酮皂苷高、低剂量组、牛膝茎叶甾酮皂苷高、低剂量组心脏、肾脏中的AT1R蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01）。从ACE2-Ang（1-7）-Mas轴机制研究:与WKY组比较,模型组ACE2、Ang（1-7）含量显著降低（P＜0.05或P＜0.01）;与模型组比较,牛膝甾酮皂苷低剂量组、牛膝茎叶甾酮皂苷低剂量组ACE2含量显著升高（P＜0.05）;牛膝茎叶甾酮皂苷高剂量组Ang（1-7）含量显著升高（P＜0.01）,氯沙坦组、牛膝甾酮皂苷高剂量组、牛膝茎叶甾酮皂苷低剂量组Ang（1-7）含量显著升高（P＜0.05）。结论:1.建立了HPLC同时测定牛膝茎叶中6种成分含量的方法,所建立的方法操作简单,重复性好。2.采收期可以选择9月下旬~10月中旬,指标成分和总甾酮、总皂苷、总多糖含量都较高。3.牛膝茎叶具有较好的抗氧化生物活性,牛膝茎叶乙醇提取物中具有抗氧化作用的成分可能是总甾酮与总皂苷,牛膝水提物中具有抗氧化作用的成分可能是多糖。4.牛膝和牛膝茎叶对活性氧诱导损伤的血管内皮细胞具有保护作用,其机制与其调节血管有关的活性因子,抑制细胞的凋亡有关。5.牛膝和牛膝茎叶都具有降压效果,可能的降压通路是作用于ACE-AngⅡ-AT1R轴。但比较牛膝来说,牛膝茎叶降压效果较弱。