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背景及意义癌症是严重威胁人类健康的恶性疾病之一。在所有癌症中,肺癌是男性死亡人数最多、女性死亡人数高居第二位的恶性肿瘤。与正常细胞通过线粒体进行氧化磷酸化不同的是,癌细胞主要通过糖酵解过程获得生命活动所需要的能量,产生大量乳酸和少量ATP,这种现象被称作瓦博格效应(Warburg effect)。磷酸果糖激酶(phosphofructokinase, PFK)是糖酵解途径中最关键的限速酶,它能够催化6-磷酸果糖反应生成1,6-二磷酸果糖。微小RNA (microRNA, miRNA)是一类内源性的、在进化上非常保守的、其长度约为22个核苷酸的非编码小RNA。经过一系列加工,成熟的miRNA能够完全或不完全地与nRNA的3’端非翻译区结合,通过抑制翻译或使得靶向mRNA降解来调节基因表达。越来越多的研究表明,niRNA在肿瘤的发生、发展中具有重要的作用；除了能够抑制癌细胞的增殖、促进癌细胞的凋亡外,miRNA还能通过调控糖代谢途径中的酶,来调节糖代谢途径,但是否存在niRNA通过靶向PFK,从而调控癌细胞糖酵解途径,目前尚不清楚。本研究旨在阐明PFK相关miRN A调控肺癌细胞糖代谢的机制,为分子靶向药物的研发提供理论依据。方法(1)通过查阅、分析文献,筛选出适合于进一步研究的肝型磷酸果糖激酶(PFK liver type, PFKL) 。(2)运用生物信息学方法筛选,发现miR-128与PFKL之间存在潜在的靶点关系。(3)根据miRNA合成原则,设计合成miR-128的mimics、inhibitor及其对应的阴性对照。用Lipofectamine 2000装miR-128的mimics和inhibitor分别转染NCI-H460 及 NCI-H1299细胞,以分别升高或降低细胞中miR-128的水平。运用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析转染后,miR-128在细胞中的表达变化,以确认转染效果。(4)用qRT-PCR分析转染相对应的RNAs之后,细胞内PFKL在nRNA水平的表达变化；Western blot分析PFKL在蛋白水平的表达变化。(5)通过双荧光素酶报告分析系统,进一步确认niR-128与PFKL之间的靶点关系。(6)运用MTT、结晶紫染色法分别分析转染RNAs之后,对细胞生长及克隆形成的影响；荧光光度法分析转染RNAs之后,对细胞内ATP含量变化的影响；分光光度法分析转染RNAs之后,对细胞葡萄糖摄入量和乳酸生成量的影响。评价miR-128表达水平的变化对肺癌细胞糖代谢的影响。(7) qRT-PCR分析干扰AKT信号通路对miR-128及PFKL表达的影响。(8)通过Western blot分析异常表达miR-128之后,对总AKT及磷酸化AKT表达量的影响,分析niR-128调控糖酵解的机制。结果(1)PFKL在肺癌细胞NCI-H460中相对高表达；miR-128在NCI-H1299中相对高表达；miR-128的表达与PFKL的表达呈负相关。(2)生物信息学筛选发现,PFKL是miR-128的潜在靶点,双荧光素酶报告分析进一步验证了它们之间存在的靶点关系。同时,miR-128表达水平上调能抑制PFKL在mRNA水平及蛋白水平的表达；反之,抑制miR-128的表达,则能促进PFKL在mRNA水平及蛋白水平的表达。共转染miR-128与PFKL的过表达载体,能够补救由miR-128引起的PFKL的表达下降。(3)上调miR-128的表达能够抑制肺癌细胞的生长以及克隆的形成；而抑制miR-128的表达,则能促进肺癌细胞的生长以及克隆的形成；干扰PFKL的表达能够抑制肺癌细胞的生长以及克隆的形成,过表达PFKL能够促进肺癌细胞的生长以及克隆的形成。(4)在临床患病样本中,PFKL的表达显著高于正常样本；而miR-128在临床患病样本中的表达则显著低于正常样本；在临床患病样本中,miR-128的表达与PFKL的表达呈负相关。(5)上调miR-128的表达能够使得肺癌细胞内ATP含量增加、葡萄糖摄入量减少以及乳酸生成量减少；而抑制miR-128的表达,则使得肺癌细胞内ATP含量减少、葡萄糖摄入量增加以及乳酸生成量增加；干扰PFKL的表达能够使得肺癌细胞内ATP含量增加、葡萄糖摄入量减少以及乳酸生成量减少,过表达PFKL能够减少肺癌细胞内ATP含量,增加葡萄糖摄入量以及乳酸生成量。(6)干扰AKT信号通路能够促进miR-128的表达；相反,干扰AKT信号通路则显著抑制PFKL在mRNA水平的表达。(7)过表达miR-128能够显著降低磷酸化AKT的表达；相反,抑制miR-128的表达对磷酸化AKT的表达无明显影响；异常表达的miR-128对总AKT水平无明显影响。结论本研究阐明了miR-128与PFKL之间的靶点调控机制,进一步验证了miRNAs对糖酵解途径中关键限速酶的调控作用。同时,研究表明,miR-128通过调控糖酵解途径中的最为关键的限速酶PFKL (PFK liver type),从而对肺癌细胞内ATP含量、肺癌细胞葡萄糖摄入量以及乳酸生成量产生影响。我们的研究结果还表明,miR-128对糖酵解过程的调节,可能是通过AKT信号通路来完成的。这些结果说明,miRNA在肺癌细胞的糖酵解途径中起着重要的作用；同时,miR-128可能作为肺癌治疗的新靶点。