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背景sigma-1受体(σiR)主要在海马、下丘脑及杏仁核的神经细胞中表达。σ1R活化能增强海马CA1区(CornuAmmonis 1 field)锥体细胞N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDA受体)介导的钙离子(Ca2+)内流,增加钙调蛋白(calmodulin)的活性,提高细胞外调节蛋白激酶(Extracellularregulated protein kinases,ERK1/2)的磷酸化水平和环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMPresponsive element binding protein,CREB)的转录水平,易化突触可塑性长时程增强(Long-term potentiation,LTP)的诱导。同时,σ1R活化对GABAA受体有负向调控作用。此外,σ1R活化能增强电压门控钙离子通道开放来增加钙离子内流。σ1R基因敲除小鼠有抑郁样的表型,但是迄今有关其分子机制仍然没有阐明。基底外侧杏仁核(Basolateral amygdala,BLA)神经元被认为是调节情感行为的重要脑区之一,小鼠BLA的锥体神经元表达σ1R。BLA主要包括两种类型的神经元:谷氨酸能神经元和GABA能中间神经元。大量的研究证明,来自于皮层外囊(External capsule,EC)的神经纤维末梢与BLA谷氨酸能神经元构建了兴奋性神经通路,GABAA受体介导了 BLA的抑制性局部回路。谷氨酸能神经元的突触可塑性LTP和长时程抑制(Long-term depression,LTD)都参与了恐惧记忆的形成和抑郁-焦虑行为的发生,如LTP是恐惧记忆形成的分子基础,而LTD的诱导能消除形成的恐惧记忆。LTP诱导依赖于NMDA受体介导的Ca2+的内流,GABAA受体介导的抑制性局部回路与LTD的诱导密切相关。此外,NMDA受体的钙离子内流通过活化突触后致密蛋白(Postsynaptic density-95,PSD-95),促进PSD-95与神经元型一氧化氮合酶(Neuronal NO synthase,nNOS)的结合从而增加一氧化氮(Nitric oxide,NO)的产生和逆行性释放,这可以增加突触前膜的谷氨酸释放。基于上述分析,本研究提出"σ1R缺失有可能通过影响BLA的突触可塑性诱发抑郁样行为"的科研设想。研究目的1.明确σ1R缺失对BLA神经回路和突触可塑性的影响及其分子机制;2.阐明σ1R缺失影响BLA的突触可塑性在小鼠抑郁样行为发生中的作用。实验方法1.σ1R基因敲除小鼠(σ1R-KO小鼠)由美国California的Zollila教授提供。提取小鼠尾巴的DNA,用PCR方法进行小鼠的基因型鉴定。2.行为学检测:用旷场实验(Open field test,OFT)评价小鼠的自主运动和探知行为。用悬尾试验(Tail suspension test,TST)和强迫游泳试验(Forced swimming test,FST)检测小鼠的抑郁样行为。3.形态学检测:制备BLA石蜡脑片,用甲苯胺蓝染色观察BLA区神经元的形态;进行BLA区的σ1R免疫组织化学染色观察σ1R的表达。4.用场电位记录外囊和BLA谷氨酸神经元的突触(EC-BLA突触)传递效应,双脉冲易化(Paired-pulse facilitation,PPF,评价突触前谷氨酸释放)和双脉冲抑制(Paired-pulse inhibition,PPI,评价抑制性神经回路功能),用高频刺激(High frequency stimulation,HFS,100 Hz,1min×5 times)诱导 LTP,用低频刺激(Low frequency stimulation,LFS,1Hz,15 min)诱导 LTD。5.用ELISA试剂盒检测BLA脑区的NO水平。6.用免疫共沉淀(Coimmunoprecipitation,Co-IP)和蛋白印迹(Western blotting,WB)的方法检测BLA区nNOS和PSD-95的结合能力;检测nNOS、PSD-95、calmodulin、NMDA受体亚基NR2A和NR2B的磷酸化水平。7.用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测AMPA受体、NMDA受体、GABAA受体的mRNA水平。实验结果1.σ1R免疫组织染色结果显示,野生型(WT)小鼠BLA区的大型神经元(谷氨酸神经元)表达σ1R。BLA脑区甲苯胺蓝细胞染色结果显示,与同龄WT小鼠相比,σ1R-KO小鼠神经元的数量和形态都没有明显改变。2.与WT小鼠相比,σ1R-KO小鼠BLA的EC-BLA突触传递的兴奋性突触后电位(fEPSP)斜率明显降低,双脉冲易化(PPF)值明显增加,提示σ1R缺失→减少谷氨酸释放→突触传递功能降低。3.与 WT 小鼠相比,σ1R-KO 小鼠 BLA 的 AMPA 受体(GluR1、GluR2)、NMDA受体(NR1、NR2B、NR2A)和GABAA受体 GABAAR-A4、GABAAR-δ)mNRA水平没有明显改变,然而NR2B亚基的磷酸化水平显著降低,NR2A亚基的磷酸化水平没有改变,提示σ1R缺失能降低NMDA受体功能。4.与 WT 小鼠相比,尽管σ1R-KO 小鼠 BLA 的 nNOS、PSD-95 和 calmodulin的蛋白水平没有明显改变,然而nNOS和PSD-95的结合水平显著降低,NO水平也降低。NMDA受体激动剂NMDA的BLA区微注射可以恢复nNOS和PSD-95的结合和NO产生,提示σ1R缺失→NMDA受体下调→降低nNOS与PSD-95结合→减少NO生成。5.在σ1R-KO小鼠脑片,NMDA或者NO供体DETA/NO处理能恢复fEPSP斜率和PPF值;nNOS抑制剂7-NI可以阻断NMDA的作用,提示σ1R缺失→减少NO生成→抑制谷氨酸释放。6.HFS能诱导WT小鼠产生NMDA受体依赖性LTP,但是在σ1R-KO小鼠HFS不能诱导LTP。在σ1R-KO小鼠脑片,NMDA处理能恢复LTP的诱导,7-NI会拮抗NMDA的作用,提示σ1R缺失→NMDA受体下调→阻止LTP诱导。7.与WT小鼠相比,σ1R-KO小鼠BLA的PPI值明显增加。GABAA受体激动剂muscimol和NMDA处理能恢复σ1R-KO小鼠的PPI值。在WT小鼠脑片,GABAAR阻断剂bicuculine处理能增加PPI值,提示σ1R缺失→减弱GABAAR介导的抑制性神经回路。8.LFS能诱导WT小鼠产生LTD,但是在σσ1R-KO小鼠LFS不能诱导LTD。bicuculine 能阻断 WT 小鼠的 LTD 诱导。muscimol,NMDA 和 DETA/NO 均可以恢复σ1R-KO小鼠LTD,提示σ1R缺失→减弱GABAA受体介导的抑制性回路→损害LTD的诱导。9.与WT小鼠相比,σ1R-KO小鼠在强迫游泳和悬尾试验中的不动时间明显延长。在σ1R-KO小鼠BLA区注射NMDA、DETA和muscimol可以逆转强迫游泳和悬尾试验中的时间延长,7-NI能拮抗NMDA的作用,提示σ1R缺失→阻碍BLA的LTD诱导→引起抑郁样行为。结论1.BLA谷氨酸神经元的σ1R缺失减少了 NMDA受体的钙离子内流从而降低nNOS与PSD-95结合导致NO生成减少;2.σ1R缺失减少NO的释放从而减少了突触前谷氨酸的释放导致突触传递功能减弱和LTP诱导障碍;3.σ1R缺失减少NO的释放从而减弱GABAA受体介导的抑制性回路导致LTD诱导障碍并发生抑郁样行为。