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病原菌侵染导致玉米产量与品质下降,威胁粮食安全。使用化学农药对环境及人体健康有害。化学防御是植物抵抗病原菌的一种重要方式,植保素是植物受到病原菌侵染时产生的小分子次生代谢物,具有良好的抗菌活性,是化学防御的重要组成部分。玉米中目前一共鉴定了三类植保素,包括二萜类的kauralexin与dolabralexin,以及倍半萜类的zealexin。研究发现,An2(Zm CPS2)、Zm KSL5、Zm TPS1或Zm KSL4参与二萜植保素的合成;Zm TPS6/11与CYP71Z18参与zealexin的合成。其中An2与Zm TPS6为两类植保素生物合成的关键酶。玉米萜类植保素及其生物合成基因的表达能够被多种真菌性病原菌诱导,且受到茉莉酸信号的调控,但目前其调控机制还不清楚。本研究通过表达模式相关性分析,筛选到候选基因ZmWRKY79与Zm EREB92,同时通过同源搜索确定另一个转录因子Zm MYC2。利用原生质体瞬时过表达与沉默体系、启动子-报告基因系统、凝胶迁移率变动分析(EMSA)、酵母单杂交、酵母双杂交、荧光双分子互补实验(Bi FC)、GST pull-down等实验技术,分析了这三个转录因子或独立或协同地调控玉米萜类植保素生物合成基因表达的机制。同时还鉴定了一个负调控因子Zm JAZ14,通过与Zm MYC2和Zm EREB92互作形成调控模块,精细调节玉米萜类植保素生物合成基因的表达。主要研究结果如下:1.通过表达模式相关性分析,发现ZmWRKY79在多种病原菌相关的胁迫下都与玉米萜类植保素生物合成关键酶基因An2与Zm TPS6存在高度相关性,因此选定其为候选基因。表达模式分析发现其与玉米萜类植保素生物合成基因的诱导表达模式类似,响应禾谷镰刀菌的侵染、多种植物激素的处理以及非生物胁迫,表明其有可能参与到植物对胁迫的应答过程中。2.在玉米原生质体中瞬时过表达ZmWRKY79显著增强玉米萜类植保素生物合成基因的表达,同时一些激素相关基因与活性氧清除相关基因也被诱导上调。进一步在原生质体中瞬时沉默ZmWRKY79,发现玉米萜类植保素生物合成基因的诱导表达情况被显著抑制,说明ZmWRKY79正调控玉米萜类植保素的生物合成。3.通过启动子-报告基因系统,发现ZmWRKY79能够激活萜类合酶基因的启动子的活性,进一步渐变缺失与定点突变的实验发现An2启动子中介导ZmWRKY79激活活性的元件为ATG上游1587-1583 bp的W-box顺式元件,介导Zm TPS6激活活性的为ATG上游587-584 bp的W-box-like顺式元件。随后通过EMSA、酵母双杂交与Ch IP-q PCR分析的发现ZmWRKY79能够通过萜类合酶基因启动子中的W-box与W-box-like与启动子直接结合。4.继续根据表达模式相关性分析筛选到转录因子Zm EREB92,另外通过同源搜索找到转录因子Zm MYC2,将二者在玉米原生质体中分别进行过表达后玉米萜类植保素生物合成基因的表达显著提高。5.亚细胞定位发现Zm EREB92与Zm MYC2均定位与细胞核,并且通过酵母双杂交、荧光双分子互补实验与pull-down分析发现二者在细胞核中互作。进一步共表达两个转录因子,萜类合酶基因的表达量在单独转化的基础上再次大幅度提高,并且还能提高ZmWRKY79的表达量,表明二者互作后协同调控玉米植保素代谢。6.通过启动子-报告基因的系统发现玉米植保素生物合成基因启动子活性也同样受到Zm EREB92与Zm MYC2的单独及协同激活。Ch IP-q PCR分析进一步表明Zm EREB92与Zm MYC2既能够单独结合到这些萜类合酶基因的启动子上,也能够以复合体的形式增强对特定片段的结合。7.Zm JAZ14是茉莉酸信号途径中的抑制因子,定位与于细胞核中。通过酵母双杂交、荧光双分子互补实验与pull-down分析发现Zm JAZ14既能与Zm EREB92互作又能与Zm MYC2互作。既能单独抑制其对下游基因的激活,又能破坏Zm EREB92与Zm MYC2的互作,使其无法行使协同功能。在原生质体共表达时加入Zm JAZ14后,萜类合酶基因协同诱导的情况被显著抑制,其启动子的活性也表现出相同的调控模式。表明Zm JAZ14负调控玉米萜类植保素生物合成。8.由Zm MYC2-Zm EREB92-Zm JAZ14形成的调控模块还能以类似的调控模式反馈调节上游茉莉酸生物合成基因的表达,并且这三个基因自身也受到茉莉酸信号的诱导,由此形成一个反馈调节的动态网络。结论:本研究发现玉米转录因子ZmWRKY79能够直接调控玉米萜类植保素生物合成的基因表达;另外两个转录因子Zm EREB92与Zm MYC2则通过单独与协同共存的两种方式激活玉米萜类植保素生物合成基因的表达,其协同作用部分依赖于ZmWRKY79的贡献。Zm JAZ14通过与Zm EREB92以及Zm MYC2互作打破二者协同作用,抑制下游基因表达。因此,在茉莉酸信号被激活时,Zm EREB92-Zm MYC2-Zm JAZ14形成一个调控模块,在调控萜类植保素代谢的同时还能反馈调节上游茉莉酸生物合成基因的表达,而Zm JAZ14将作为该调控模块的微调开关,实现对玉米萜类植保素代谢的精细调控。通玉米萜类植保素调控机制的解析,将有利于挖掘植物自身的化学防御潜能,同时也对研究作物抗性和生长平衡机制具有重要意义。