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研究目的:肺癌是目前世界范围内常见的恶性肿瘤之一,其男性和女性肺癌发病率占恶性肿瘤的14%和12%,死亡率占恶性肿瘤的比例高达27%和25%。目前探索和发现新的癌基因和抑癌基因,阐明其作用机制并开展有效的靶向治疗,成为肺癌研究的热点和难点。人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是一种环状双链DNA病毒,其感染与人类多种疾病相关,其中高危型HPV的持续感染与宫颈癌的发生密切相关。Syrj?nen于1979年首先提出HPV感染可能在肺癌的发生过程中起着重要的作用。随着分子生物学的飞速发展,现已发现高危型HPV16在肺癌的发生中是最常见的感染类型,HPV16中的E6和E7蛋白是肺癌发生发展中的主要致癌基因。本研究通过讨论肺癌患者与良性病变患者的胸膜腔积液细胞中HPV16 E7、CDK4/6、Fox M1、P16和ACP5的表达,在肺癌细胞系中研究HPV16 E7、CDK4/6、Fox M1、P16和ACP5之间所存在的负反馈调控关系,初步阐明HPV16 E7能通过P16-p Rb通路中CDK6/Fox M1表达上调负反馈抑制P16蛋白表达。因此,发现和研究新的具有应用前景的肿瘤相关基因和相关通路,有助于进一步揭示肺癌的发病机理,能为肺癌提供早期预防,预后及治疗提供新的生物标志物和特异性的药物靶点。研究方法:1.在中国医科大学第一附属医院细胞病理学实验室收集2016年4月至2017年1月,212例患者的浆膜腔液样本。样本含128例胸膜腔液、69例腹膜腔液和15例心包腔液。在212个腺癌细胞积液标本中,128例为恶性,84例为良性和炎性间皮细胞。2.H460细胞系从上海细胞库获得,LK2细胞系由Hiroshi Kijima教授提供。3.酸性磷酸酶染色:样本分别用于常规的细胞学检查和ACP染色。染色试剂采用ACP染色试剂盒。计算ACP染色的敏感性、特异性和准确性用来衡量ACP的诊断效能。4.我们在肺癌细胞系中调控E7的表达,应用蛋白免疫印迹和定量即时聚合酶链锁反应(q RT-PCR),检测P16、CDK4/6、Fox M1和ACP5的m RNA和蛋白表达变化。随后我们分别干扰P16、CDK4、CDK6和Fox M1,检测其下游基因的m RNA和蛋白表达变化。研究结果:1.ACP在良性积液中的表达水平和表达强度明显高于恶性积液(p<0.01)。淋巴细胞或粒细胞中没有获得ACP阳性信号。2.ACP染色在鉴别诊断良恶性浆膜腔积液、胸腔积液、腹水和心包积液中,敏感度显著优于细胞学检查,特异性达到100%。3.H460细胞系转染HPV16 E7后,明显上调了P16、CDK6、Fox M1及ACP5的蛋白表达,但明显下调了CDK6、Fox M1及ACP5的m RNA表达。4.LK2细胞系干扰HPV16 E7后,明显下调了P16、CDK6、Fox M1及ACP5的蛋白表达,同时明显下调了CDK6、Fox M1及ACP5的m RNA表达。5.LK2细胞系干扰P16后,其下游CDK4、CDK6、Fox M1和ACP5蛋白质水平与m RNA水平均上调,表明P16对其下游靶基因具有负向调控作用。6.H460细胞系分别干扰CDK4、CDK6和Fox M1后,其下游指靶基因蛋白水平均下调,m RNA水平变化不明显,结果表明CDK4、CDK6和Fox M1对其下游靶基因均存在正向调控作用。研究结论:鸡尾酒式酸性磷酸酶染色,在鉴别浆膜腔液中的反应性间皮细胞和腺癌细胞,具有重要的临床应用价值。可在临床建立新的检测定性方法。HPV16 E7、P16、CDK6、Fox M1和ACP5在肺癌发生发展中存在调控通路的作用,我们的研究成果为进一步阐明HPV在肺癌发生发展中的作用机制提供了客观的实验依据。