论文部分内容阅读
目的：通过动物体内实验确定2′-5′寡腺苷酸合成酶(2′-5′Oligoadenylate synthetase,OAS)基因启动子介导的重组型Caspase-3治疗系统诱导表达HCV核心蛋白的HepG2细胞凋亡的特异性。
方法：首先将pcDNA3.1-HCV-core-EGFP转染HepG2细胞，建立稳定表达HCV核心蛋白的细胞系。然后将转染HCV核心蛋白表达质粒和未转染的HepG2细胞接种裸鼠皮下，待形成肿瘤后，将半乳糖基-壳聚糖-聚乙烯亚胺(galactosylated chitosan-graft-polyethyleneimine,GC-PEI)包被的pcDNA3.1-re-Caspase-3质粒（阳性对照）、pGL3-OAS-re-Caspase-3质粒和空白质粒pcDNA3.1（阴性对照）注入裸鼠皮下肿瘤，48小时后处死动物，取肿瘤。利用HCV核心蛋白抗体检测肿瘤组织中HCV核心蛋白的表达及阳性细胞率。利用抗人的Caspase-3单克隆抗体和HCV核心蛋白抗体对肿瘤组织进行免疫荧光双标记检测，观察导入的重组Caspase-3基因和HCV核心蛋白的表达。TUNEL技术检测HepG2细胞的凋亡率。透射电镜观察HepG2细胞凋亡的形态学改变。
结果：①荧光显微镜观察、RT-PCR及免疫细胞化学证实成功建立了稳定表达HCV核心蛋白的肝癌细胞系HepG2/core。②成功建立裸鼠皮下肝癌移植瘤模型，以皮下结节直径超过0.5cm为成瘤标准，2周左右成瘤，成瘤率100％。③免疫组化检测HepG2/core组肿瘤组织HCV表达阳性率为78±8％。免疫荧光双标记Caspase-3和HCV-core，结果显示HepG2/core/pGL3-OAS-re-Caspase-3组Caspase-3阳性细胞占81±6％，共表达细胞占76±6％；HepG2/core/pcDNA3.1-re-Caspase-3组Caspase-3阳性细胞占72±5％，共表达细胞占35±8％；HepG2/core/pcDNA3.1组Caspase-3阳性细胞仅占10±3％，共表达细胞占8±3％。TUNEL技术检测各组HepG2细胞的凋亡指数，并经过统计学分析得出HepG2/core组中实验组pGL3-OAS-re-Caspase-3的凋亡指数(111±9/HP)与阳性对照组pcDNA3.1-re-Caspase-3(122±10/HP)无显著差异(P＞0.05)，但明显高于阴性对照组pcDNA3.1(10±2/HP)(P＜0.05)；实验组pGL3-OAS-re-Caspase-3在HepG2/core组的凋亡指数明显高于HepG2组(13±5/HP)(P＜0.05)。透射电镜观察到HepG2/core/pGL3-OAS-re-Caspase-3组的HepG2细胞出现体积变小，胞质浓缩，胞核的染色质高度凝聚、边缘化等凋亡形态学改变。
结论：①pGL3-OAS-re-Caspase-3系统在体内能特异性地诱导HCV核心蛋白阳性肝癌细胞凋亡。②pGL3-OAS-re-Caspase-3治疗系统有可能发展成为一种特异性强、疗效及应用前景好的HCV基因治疗策略。