【摘 要】
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lncRNA是一类>200 nt没有明显的蛋白质编码潜能的RNA分子,其可以参与多种生物学过程,并逐步成为科学研究的一个热点领域。有关lncRNA参与调控抗药性的研究仍然处于起步阶段,相关报道较少,lncRNA参与棉蚜对于螺虫乙酯抗药性的相关研究还未有报道。棉蚜作为一种的世界性害虫,对多种杀虫剂具有广谱抗性,因此,研究棉蚜抗性机制有重要的意义。在本研究中,我们利用高通量测序技术分析鉴定螺虫乙酯抗性
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lncRNA是一类>200 nt没有明显的蛋白质编码潜能的RNA分子,其可以参与多种生物学过程,并逐步成为科学研究的一个热点领域。有关lncRNA参与调控抗药性的研究仍然处于起步阶段,相关报道较少,lncRNA参与棉蚜对于螺虫乙酯抗药性的相关研究还未有报道。棉蚜作为一种的世界性害虫,对多种杀虫剂具有广谱抗性,因此,研究棉蚜抗性机制有重要的意义。在本研究中,我们利用高通量测序技术分析鉴定螺虫乙酯抗性品系与敏感品系棉蚜中差异表达的lncRNA基因,测序得到的lncRNA片段数共7025条。转录组数据质量达到Q30的均超过90%,证明本次高通量测序所得的转录组数据真实可靠。以SS品系作为对照,在SR品系中,差异表达的非编码基因有945个,其中上调的非编码基因有472个,下调的非编码基因有473个。对差异表达lncRNA的靶基因进行富集性分析,在功能方面,差异表达lncRNA靶基因显著富集在代谢进程、细胞进程、细胞膜、细胞膜组分、结合功能、催化活性中。在通路方面,差异lncRNA靶基因在脂肪酸延伸、多型O-聚糖生物合成与醚脂质代谢通路上富集,表明差异lncRNA可能参与调控这些通路上的基因,这些调控通路可能与棉蚜对螺虫乙酯抗性相关。螺虫乙酯的作用靶标为乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-Co A carboxylase,ACC),其抑制ACC的表达,减少总脂质的生物合成。我们对参与ACC调控的lncRNA进行整理预测,找到可能参与顺式调控ACC的非编码RNA MSTRG.28822,其位于ACC 3’端反义链上,共有5条转录本。对SS与SR品系棉蚜该lncRNA进行定量分析,结果显示,MSTRG.28822基因表达量是敏感品系该基因表达量的0.78倍,与转录组数据相符。合成三条si RNA,利用三明治法对SR品系棉蚜进行喂食,以靶向敲除MSTRG.28822。进行荧光定量PCR验证三条si RNA对lncRNA MSTRG.28822干扰效率,lncRNA MSTRG.28822的相对表达量分别被抑制43.23%、48.24%、59.13%,ACC的相对表达量分别提高51.32%、55.70%、11.99%,实验表明,MSTRG.28822与ACC表达量呈现负相关,即MSTRG.28822可能参与抑制ACC的表达。对脂肪酸合成通路上ACC下游基因进行实时荧光定量,四个FAS基因有不同程度的上调;对MSTRG.28822沉默后棉蚜螺虫乙酯敏感性检测,处理组棉蚜对螺虫乙酯敏感性下降。实验初步表明MSTRG.28822可能参与棉蚜对螺虫乙酯的抗药性。为研究lncRNA转录调控机制,通过分析MSTRG.28822上游5’侧翼序列,找到相关转录因子的结合位点,我们筛选出7个转录因子,通过RNAi靶向敲除相关转录因子,结果显示:C/EBP、C/EBPzeta表达水平下降至0.68倍、0.80倍时,lncRNA MSTRG.28822的转录水平分别下降至0.47倍、0.50倍,从实验结果可以看出,C/EBP、C/EBPzeta这2个转录因子可能参与棉蚜MSTRG.28822的转录调控。该实验为后续相关转录因子的验证以及启动子活性分析提供了一定的理论基础。本研究的结果有助于深入了解非编码RNA在棉蚜抗药性方面的作用以及棉蚜螺虫乙酯抗性相关分子机制。
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