microRNA是一种调节性的非编码小分子RNA,其在生命活动中起着重要的作用。microRNA一般作用于靶标分子mRNA的非编码区,通过不完全互补配对的方式抑制靶标mRNA的翻译,从而对靶标基因在转录后水平进行调控。研究表明,microRNA在多种病毒感染过程中起着重要的调节作用,很可能在对猪瘟病毒(CSFV)的感染起着直接的调节作用。这种调节可能是由microRNA与CSFV的3’非编码区相互作用来实现的。通过生物信息预测,发现多种microRNA可能在CSFV上有作用位点。为研究microRNA在猪瘟病毒感染中可能起到的作用,本研究构建了绿色荧光蛋白报告系统,以利用绿色荧光蛋白来筛查microRNA在CSFV 3’非编码区的作用位点;同时还建立了表达miR-150 shRNA的PK-15细胞系,为研究microRNA对CSFV感染中的潜在作用打下基础。本研究获得以下结果:1.在猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)上增殖CSFV石门株,对其增殖状况进行检测;设计引物,通过RT-PCR方法成功地扩增出了与预期大小相符的CSFV 3’UTR片段,与克隆载体pMD18-T载体连接后,经鉴定得到了猪瘟病毒石门株的3’UTR区域;重组克隆载体经酶切回收3’UTR片段,并将其连入真核表达载体pEGFP-C1,经酶切以及测序鉴定正确,表明成功地构建了融合猪瘟病毒石门株3’UTR片段的绿色荧光蛋白报告基因质粒载体;质粒用QIAGENE Plasmid Mini Kit纯化,获得了较高纯度的质粒DNA。2.采用RNA22和miRanda等软件,分别用已知的猪源microRNA和人源microRNA对猪瘟病毒基因组进行扫描,总结了其中可能作用于CSFV基因组上的microRNA,并重点对可能作用于CSFV非编码区的microRNA进行了关注,发现了猪的11个可能与CSFV基因组直接作用的microRNA。3.设计并合成了表达miR-150的两条shRNA序列的DNA单链,将其退火后与干扰载体pGenesil-1连接并测序鉴定了该重组载体的正确性,提取并纯化质粒后,由脂质体转染方法高效地转入PK-15细胞;通过G418抗性筛选获得了转染pGenesil和pGene-miR-150的阳性细胞,再由有限稀释法分别获得了转染pGenesil和pGene-miR-150质粒的PK-15细胞株,细胞株能分别持久转录表达miR-150的shRNA。