研究背景骨质疏松症是中老年人群的常见病,以全身骨量减少,骨组织的微细结构破坏,骨强度降低和骨折危险性增高为特征。骨质疏松症最大的危害是骨质疏松性骨折,其中以髋部骨折危害最大,不仅髋部活动功能损伤明显,而且死亡率高。随着老龄化社会的到来,骨质疏松症防治的临床与基础研究已成为医学界研究的热点。运动是预防和治疗骨质疏松的重要因素。近年来,具有无创、副反应小、依从性好等特点的物理因子疗法防治骨质疏松症逐渐受到重视。全身振动运动是振动疗法中的一种,是指借助于振动仪器,使振动刺激通过下肢或躯干作用于全身,使机体整体振动,以达到防治疾病目的的方法。对去卵巢模型动物、低骨量人群及绝经后女性的研究显示,低于引起组织损伤的机械振动信号---低强度高频率振动(Low-magnitude, high-frequency vibration, LMHFV),且有较好的增加骨形成和抑制骨吸收作用。作为一种治疗骨质疏松症的新方法,LMHFV具有无创、副反应小、高依从性的特点,能降低骨质疏松性骨折的发生率,在骨质疏松症的预防和治疗领域越来越受到重视。但是,LMHFV增加骨形成、抑制骨吸收的具体机制仍不清楚。研究证明,振动应力可以影响成骨细胞的生物学特性,但振动应力影响成骨细胞生物学特性的具体机制尚不清楚。因此,研究振动应力影响成骨细胞生物学特性的分子机制,以其作为切入点进一步阐明LMHFV预防和治疗骨质疏松的机制,将为全身振动运动预防和治疗骨质疏松提供科学依据。本研究通过自行研制的细胞振动仪,对体外培养的成骨前体MC3T3-E1细胞施加低强度(0.3g)、不同高频率(0、30、45、60、90Hz)振动(LMHFV),结合分子生物学检测技术,观察LMHFV对成骨前体MC3T3-E1细胞生物学特性的影响及其机制的初步研究。研究内容如下：目的1.研究低强度高频率振动(LMHFV)对成骨细胞生物学特性的影响。2.研究环氧合酶-2(COX-2)在LMHFV影响成骨细胞生物学特性中的作甩。3。研究LMHFV诱导成骨细胞COX-2蛋白表达的信号转导机制。方法I。低强度、高频率振动(LMHFV)影响成骨细胞生物学特性的作用1. LMHFV影响成骨细胞OPG/RANKL比率的作用(1)LMHFV对成骨细胞OPG/RANKL比率的影响对MC3T3-E1细胞施加频率0、30、45、60、90Hz,强度0.3g,时间30min的振动,分别于振动后0、0.5、1.5、3、6h收集细胞培养上清液。用酶联免疫吸附法(ELISA)检测LMHFV加载后不同时间MC3T3-E1细胞分泌可溶性OPG、RANKL的情况。通过计算OPG/RANKL比率,将增加OPG/RANKL比率最高的振动频率做为本实验继续研究的频率。(2)LMHFV加载成骨细胞条件培养基(Conditioned medium, CM)对破骨细胞分化成熟的影响LMHFV (30Hz)加载MC3T3-E1细胞后含OPG/RANKL比率最高的条件培养基(Conditioned medium, CM30HZ)及LMHFV (OHz)加载后的条件培养基(Conditioned medium, CM0Hz),分别与含40ng/ml sRANKL、20ng/ml M-CSF的1640培养基按体积比1：1混合形成混合培养基。将破骨细胞前体RAW264.7细胞随机分为Control组(CM0Hz)、实验组(CM30Hz),混合培养基分别诱导破骨细胞前体RAW264.7细胞分化5、7天。①实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative PCR, qPCR)分别检测第5、7天各组抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP) mRNA的表达水平；②TRAP检测试剂盒检测第5、7天各组TRAP活性；③TRAP染色计算第7天各组多核破骨细胞形成数目。2. LMHFV影响成骨细胞分化的作用(1) LMHFV对成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN) mRNA表达的影响：MC3T3-E1细胞随机分为Control组(0Hz)、LMHFV组(30Hz), Control组不予振动刺激,LMHFV组给予振动刺激(0.3g,30Hz,30min/day),分别加载4、8天后,收集细胞,提取细胞总RNA。实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative PCR, qPCR)检测ALP mRNA、OCN mRNA表达,以GAPDH(?)内对照,分析ALP mRNA、OCN mRNA相对表达的变化。(2) LMHFV对成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素(OCN)表达的影响：MC3T3-E1细胞随机分为Control组(0Hz)、LMHFV组(30Hz), Control组不予振动刺激,LMHFV组给予振动刺激(0.3g,30Hz,30min/day),分别加载4、8天后,收集细胞,提取细胞总蛋白,ALP检测试剂盒检测ALP活性；OCN ELISA试剂盒检测OCN表达；ALP活性、OCN表达均以细胞总蛋白量标准化,分析ALP活性、OCN表达相对改变的变化。(3) LMHFV对成骨细胞矿化结节形成的影响：MC3T3-E1细胞随机分为Control组(0Hz)、LMHFV组(30Hz), Control组不予振动刺激,LMHFV组给予振动刺激(0.3g,30Hz,30min/day),培养14天后,茜素红染色观察矿化结节形成情况。Ⅱ.环氧合酶(COX-2)在LMHFV影响成骨细胞生物学特性中的作用1. LMHFV对成骨细胞COX-2 mRNA及蛋白表达的影响MC3T3-E1细胞随机分为Control组(OHz). LMHFV组(30Hz), Control组不予振动刺激,LMHFV组给予振动刺激(0.3g,30Hz,30min)。分别于LMHFV干预结束后0、0.5、1.5、3、6h-①提取细胞总RNA, qPCR法检测COX-2 mRNA表达,以GAPDH为内对照,分析COX-2 mRNA相对表达的变化；②提取细胞总蛋白,Western blot检测COX-2蛋白表达,以β-actin为内对照,分析COX-2蛋白相对表达的变化。2. LMHFV对成骨细胞表达PGE2活性的影响MC3T3-E1细胞随机分为Control组(OHz)、LMHFV组(30Hz), Control组不予振动刺激,LMHFV组给予振动刺激(0.3g,30Hz,30min)。分别于LMHFV加载结束后0、0.5、1.5、3、6h收集细胞培养上清、提取细胞总蛋白；在COX-2特异性抑制剂NS-398抑制实验中,MC3T3-E1细胞先与10μM NS-398孵育1h,再施加LMHFV刺激,在LMHFV干预结束后0.5h分别收集细胞培养上清、提取细胞总蛋白；ELISA法检测细胞培养上清液中PGE2活性,并以细胞总蛋白量标准化,分析PGE2活性相对表达的变化。3。COX-2特异性抑制剂NS-398对LMHFV增加成骨细胞OPG分泌的影响MC3T3-E1细胞随机分为Control (OHz)+VEHICLE组、Control (OHz) +NS-398组、LMHFV (30Hz)+VEHICLE组、LMHFV (30Hz)+NS-398组。VEHICLE为溶解NS-398的等量DMSO, MC3T3-E1细胞先与10μMNS-398孵育1h,再施加LMHFV (0.3g,30Hz,30min)刺激,在LMHFV干预结束后6h分别收集细胞培养上清、提取细胞总蛋白；ELISA法检测细胞培养上清液中可溶性OPG活性,并以细胞总蛋白量标准化,分析OPG分泌的变化。4。COX-2特异性抑制剂NS-398对LMHFV诱导成骨细胞分化作用的影响MC3T3-E1细胞随机分为Control (OHz)+VEHICLE组、Control (OHz)+NS-398组、LMHFV (30Hz)+VEHICLE组、LMHFV (30Hz)+NS-398组。干预方法为：对细胞施加8天的LMHFV (0.3g,30Hz,30min/day)刺激,VEHICLE为溶解NS-398的等量DMSO,细胞与10μM NS-398孵育8天,干预结束后,分别收集细胞、提取细胞总蛋白；按前述方法分别检测ALP活性、OCN表达,并以细胞总蛋白量标准化,分析ALP活性、OCN表达相对改变的变化。Ⅲ. LMHFV诱导成骨细胞COX-2表达的信号转导机制1. LMHFV诱导成骨细胞COX-2表达的信号转导途径初探分别于MC3T3-E1细胞施加LMHFV (0.3g,30Hz,30min)刺激前1h加入各种信号通路抑制剂NS-398、Staurosporine、H-89、U0126、SP600125、SB203580,于LMHFV加载结束后3小时,提取细胞总蛋白。Western blot检测COX-2蛋白表达,以β-actin为内对照,分析COX-2蛋白相对表达的变化。2. cAMP/PKA信号通路对LMHFV诱导成骨细胞COX-2表达的影响(1) LMHFV对成骨细胞PKA信号通路的影响MC3T3-E1细胞随机分为Control组(OHz)、LMHFV组(30Hz), Control组不予振动刺激,LMHFV组给予振动刺激(0.3g,30Hz,30min),分别于LMHFV加载结束后0、0.5、1.5、3、6h收集细胞,提取细胞总蛋白。Western blot检测PKA总蛋白及磷酸化蛋白含量,以总蛋白为对照,分析PKA磷酸化蛋白含量相对值的变化。(2) LMHFV对成骨细胞内cAMP水平的影响MC3T3-E1细胞随机分为Control组(0Hz)、LMHFV组(30Hz), Control组不予振动刺激,LMHFV组给予振动刺激(0.3g,30Hz,30min),分别于LMHFV加载结束后0、0.5、1.5、3、6h收集细胞。cAMP ELISA试剂盒检测LMHFV对成骨细胞内cAMP水平的影响。(3) LMHFV加载成骨细胞含PGE2条件培养基(Conditioned medium,CMPEG2)对成骨细胞内cAMP水平的影响：LMHFV加载MC3T3-E1细胞结束后0.5h,分别收集0Hz、30Hz组含PGE2的条件培养基(CMPGE2),随机将MC3T3-E1细胞分为CM0Hz组、CM30Hz组,与相应的CMPGE2分别共孵育0、0.5、1.5、3、6h后收集细胞,cAMP ELISA检测试剂盒检测CMPGE2对成骨细胞内cAMP水平的影响。(4)腺苷酸环化酶激活剂(Forskolin, FSK)对成骨细胞内cAMP水平的影响：MC3T3-E1细胞与15μM FSK分别共孵育0、0.5、1.5、3、6h或分别与0、5、10、15、20μM FSK共孵育3h后,按cAMP ELISA检测试剂盒要求收集细胞,检测含FSK对成骨细胞内cAMP水平的影响。(5)PKA抑制剂对LMHFV、FSK、CMPGE2诱导成骨细胞COX-2蛋白表达的影响在MC3T3-E1细胞接受各种干预因素前加入30μM H-89孵育1h,分别于LMHFV (0.3g、30Hz、30min)加载细胞后3h、15μM FSK刺激细胞后3h、CMPGE2孵育细胞后3h,收集细胞,提取总蛋白。Western blot检测COX-2蛋白表达情况,β-actin为内对照,分析COX-2蛋白相对表达的变化。结果Ⅰ。低强度高频率振动(LMHFV)影响成骨细胞生物学特性的作用1. LMHFV影响成骨细胞OPG/RANKL比率的作用(1) LMHFV对成骨细胞表达OPG/RANKL比率的影响：LMHFV加载结束后6h,与0Hz相比,30Hz LMHFV能明显促进成骨细胞分泌OPG(P<0.001),但对RANKL的分泌无明显影响,30Hz LMHFV提高成骨细胞OPG/RANKL比率最显著(P<0.001)。(2) LMHFV加载成骨细胞条件培养基(Conditioned medium, CM)对破骨细胞分化成熟的影响LMHFV加载结束后6小时,与0Hz相比,30Hz形成的CM含OPG/RANKL比率最高。①与含CM0Hz的混合培养基组相比,在第5天,CM30Hz组TRAP mRNA及活性均较CM0Hz组低,差异无统计学意义(P=0.069,P=0.160)；在第7天,CM30Hz组TRAP mRNA及活性均较CM0Hz组低,差异有统计学意义(P<0.001,P=0.043)；②与含CM0Hz的混合培养基组相比,在第7天,CM30Hz组形成的多核(≥3个核)破骨细胞数量减少,其中10核以上破骨细胞数量减少的差异有统计学意义(P<0.001)。2. LMHFV影响成骨细胞分化的作用(1) LMHFV对成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN) mRNA表达的影响：LMHFV加载MC3T3-E1细胞4天,与0Hz组相比,30Hz组增加MC3T3-E1细胞ALP mRNA水平,其差异有统计学意义(P=0.006); LMHFV加载MC3T3-E1细胞8天,与0Hz组相比,30Hz组增加MC3T3-E1细胞ALP mRNA及OCN mRNA水平,其差异均有统计学意义(P=0.003,P=0.001)。(2) LMHFV对成骨细胞ALP活性、OCN表达的影响：LMHFV加载MC3T3-E1细胞4天,与0Hz组相比,30Hz组增加MC3T3-E1细胞ALP活性,其差异有统计学意义(P=0.031)；LMHFV加载MC3T3-E1细胞8天,与0Hz组相比,30Hz组增加MC3T3-El细胞ALP活性及OCN表达,其差异均有统计学意义(P=0.003,P=0.001)。(3) LMHFV对成骨细胞矿化结节形成的影响：生长至80%-90%汇合的MC3T3-E1细胞,经OHz.30Hz LMHFV加载14天后,茜素红染色结果显示0Hz组、30Hz组LMHFV均可见橘红色钙化结节,但30Hz组钙化结节数目较0Hz组多,颜色较0Hz组深。Ⅱ.COX-2在LMHFV影响成骨细胞生物学特性中的作用1.LMHFV对成骨细胞COX-2 mRNA及蛋白表达的影响(1)与Control组相比,30Hz LMHFV加载成骨细胞后0、0.5、1.5、3、6h,振动组COX-2 mRNA表达均较Control组增加(all P<0.01),其中LMHFV加载后0.5h COX-2 mRNA表达水平最高(P<0.001)；(2)与Control组相比,30Hz LMHFV加载成骨细胞后0.5、1.5、3、6h,振动组COX-2蛋白表达均较Control组增加(all P<0.01),其中LMHFV加载后3h COX-2蛋白表达水平达到高峰(P<0.01)。2. LMHFV对成骨细胞PGE2活性表达的影响与Control组相比,30Hz LMHFV加载成骨细胞后0、0.5、1.5、3、6h,振动组PGE2活性表达均较Control组增加(all P<0.05),其中LMHFV加载后0.5h PGE2活性表达水平最高(P=0.032)。LMHFV加载后0.5h,COX-2特异性抑制剂NS-398对LMHFV诱导MC3T3-E1细胞PGE2活性增加具有明显的抑制作用(P<0.001)。3.COX-2特异性抑制剂对LMHFV增加成骨细胞OPG分泌的影响COX-2特异性抑制剂NS-398对30Hz LMHFV加载成骨细胞后6h OPG的分泌具有抑制作用(P=0.012),NS-398可抑制LMHFV诱导的OPG/RANKL比率升高。4.COX-2特异性抑制剂对LMHFV诱导成骨细胞分化作用的影响对30Hz LMHFV加载成骨细胞8天,COX-2特异性抑制剂NS-398可明显抑制LMHFV诱导的ALP活性、OCN表达增加(P=0.005,P=0.001)。Ⅲ. LMHFV诱导成骨细胞COX-2蛋白表达的信号转导机制1.LMHFV诱导成骨细胞COX-2蛋白表达的信号转导途径初探COX-2特异性抑制剂NS-398、PKA特异性抑制剂H-89、ERK1/2特异性抑制剂U0126、p38.特异性抑制剂SB203580均可抑制LMHFV诱导成骨细胞COX-2蛋白的表达(a11 P<0.05),而PKC特异性抑制剂Staurosporine和JNK特异性抑制剂SP600125对LMHFV诱导成骨细胞COX-2蛋白表达无明显影响。2. cAMP/PKA信号通路对LMHFV诱导成骨细胞COX-2蛋白表达的影响(1) LMHFV对成骨细胞PKA信号通路的影响与Control组相比,30Hz LMHFV加载成骨细胞后0、0.5、1.5、3h,LMHFV组PKA磷酸化活性均较Control组高,其差异均有统计学意义(allP<0.01),其中LMHFV加载后1.5h PKA磷酸化水平最高(P<0.001)。(2) LMHFV对成骨细胞内cAMP水平的影响与Control组相比,30Hz LMHFV加载成骨细胞后0、0.5、1.5h,振动组细胞内cAMP水平均较Control组增加(P<0.001,P=001,P=008),其中LMHFV加载后0.5h cAMP水平最高(P=008)。(3) LMHFV加载成骨细胞含PGE2条件培养基(Conditioned medium, CMPGE2)对成骨细胞内cAMP水平的影响：LMHFV加载成骨细胞后0.5h形成的CM含PGE2水平最高,与Control组相比,CMPGE2孵育细胞0.5、1.5、3h后,CMPGE2组细胞内cAMP水平均较Control组高(all P<0.05),其中在1.5h, CMPGE2组细胞内cAMP水平最高(P<0.05)。(4)腺苷酸环化酶激活剂(Forskolin, FSK)对成骨细胞内cAMP水平的影响：与Control组相比,15μM FSK与成骨细胞孵育0.5、1.5、3h后,FSK组细胞内cAMP水平较对照组明显升高(P=0.003,P<0.001,P<0.001),其中在3h, FSK组细胞内cAMP水平最高。(5)PKA抑制剂对LMHFV、FSK、CMPGE2诱导成骨细胞COX-2蛋白表达的影响与Control组相比,LMHFV, FSK及CMPGE2均能诱导成骨细胞COX-2蛋白表达(P<0.001,P=001,P=008),PKA特异性抑制剂H-89均能抑制LMHFV,FSK及CMPGE2诱导成骨细胞COX-2蛋白的表达(P=001,P=001,P<0.001)。结论1.低强度(0.3g),高频率(30Hz)振动(LMHFV)对成骨前体MC3T3-E1细胞生物学特性具有积极的影响：增加MC3T3-E1细胞OPG分泌,提高OPG/RANKL浓度比；促进MC3T3-E1细胞成骨分化。2.COX-2信号参与了LMHFV对成骨细胞生物学特性的影响。LMHFV诱导MC3T3-E1细胞COX-2蛋白表达可能通过PKA、ERK1/2及p38信号通路；PGE2的自分泌作用在LMHFV通过PGE2/cAMP/PKA信号通路诱导MC3T3-E1细胞COX-2蛋白表达中起重要作用。